Trabajo Prctico N 5 METABOLISMO MICROBIANO Microbiologa General

Trabajo Práctico N° 5 METABOLISMO MICROBIANO Microbiología General FCA – UNJu 2021

Pruebas metabólicas Repetir hasta obtener colonias puras Para las pruebas metabólicas se realiza cultivo de 12 -24 h de la bacteria

A) Pruebas de enzimas respiratorias a) Prueba de la oxidasa - Las oxidasas participan en reacciones de oxido-reducción durante la respiración aeróbica (citocromo tipo aa 3) -Se basa en la capacidad del colorante paminodimetilanilina de oxidarse al donar electrones al citocromo c.

OXIDASA POSITIVA La bacteria si posee citocromo c oxidasa, por lo que puede usar oxígeno en la producción de energía. La bacteria puede ser aerobia, anaerobia facultativo o microaerófila. OXIDASA NEGATIVA No puede usar el oxígeno en la cadena de transferencia de electrones o aplican una citocromo diferente.

b) Prueba de la catalasa - Algunas bacterias contienen flavoproteínas que reducen el O 2 resultando en la producción de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) o superóxido (O 2 -). Estos son extremadamente tóxicos (oxidantes potentes). - Aerobios y anaerobios facultativos suelen contener las enzimas superóxido dismutasa, y ya sea catalasa o peroxidasa. - La mayoría de anaerobios estrictos carecen ambas enzimas.

B) Metabolismo de Sustancias Nitrogenadas a) Prueba de Reducción de Nitrato - Las bacterias quimiolitotróficas y muchos quimioorganoheterotrofos pueden utilizar nitrato (NO-3) como aceptor de electrones terminal durante la respiración anaeróbica. - En este proceso, el nitrato se reduce a nitrito (NO-2) por acción de la nitrato reductasa.

Rvo. De Griess Caldo de nitrato: peptona 5 g, extracto de carne 3 g, nitrato de potasio 1 g, agua destilada 1000 ml, p. H 7, 2.

b) Producción del indol (desaminación del triptófano) Fórmula (en gramos por litro) Tripteína Peptona 20. 0 6. 1 Sulfato de hierro y amonio 0. 2 Tiosulfato de sodio 0. 2 Agar 3. 5 p. H final: 7. 3 ± 0. 2

c) Prueba de fenil alanina desaminasa - El aminoácido fenilalanina sufre la desaminación por la enzima fenilalanina desaminasa, para producir ácido fenilpirúvico y amoníaco. - El ácido fenilpirúvico es revelado con el agregado de cloruro férrico en medio ácido, con el cual se forma un quelato de color verdoso. Fórmula (en gramos por litro) Extracto de levadura 3. 0 DL-Fenilalanina Fosfato disódico 2. 0 1. 0 Cloruro de sodio 5. 0 Agar 12. 0 p. H final: 7. 3 ± 0. 2

d) Prueba de la ureasa Algunas bacterias poseen la ureasa que hidroliza la urea, formando: amoníaco, CO 2 y agua. Se detecta en un medio que contiene urea y usando un indicador de p. H como el rojo fenol. El aumento de p. H hace que el indicador cambie de rojo-anaranjado a rosa profundo o rojo violáceo. Medio ureasa (g/L): urea 20 g, KH 2 PO 4 9, 1 g, Na 2 HPO 4 0, 1 g, rojo fenol 0, 01 g, extracto de levadura 0, 1 g, p. H 6, 8.

e) Prueba del ácido sulfhídrico Indica la presencia de la enzima cisteína desulfurasa o tiosulfato reductasa Cisteína posee azufre en su estructura El medio también posee azufre H 2 S se revela con sulfato de amonio ferroso, Fe (NH 4)2 SO 4 Reacción (+) precipitado negro de sulfato ferroso Fe. S Medio SIM (g/L): tripteína 20 g; peptona 6, 1 g; sulfato de hierro y amonio 0, 2 g; tiosulfato de sodio 0, 2; agar 3, 5; p. H 7, 3.

f) Prueba de la ornitina-decarboxilasa La eliminación de grupos carboxilos (ácidos) del aminoácido ornitina, produce aminas alcalinas como la putrescina, que eleva el p. H del medio. (+) color púrpura. (-) color amarillo, a veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. Medio M. I. O. (g/L): glucosa 1 g, extracto de levadura 3 g, peptona de carne 10 g, triptona 10 g, L-ornitina 5 g, púrpura de bromocresol 0, 02 g, agar 2 g, p. H 6, 5.

C) Metabolismo de Hidratos de Carbono a) Utilización de Glucosa (OF) - Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. - La principal diferencia es la necesidad de oxígeno atmosférico. - Por ello se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxígeno.

Resultados El uso del hidrato de carbono, ya sea por fermentación u oxidación, produce acidez. a-Microorganismos oxidativos del hidrato de carbono en estudio: producen una reacción ácida solo en el tubo “abierto”. Presentan poco o nulo desarrollo y ausencia de producción de ácido en el tubo “cerrado”. b-Microorganismos fermentadores del hidrato de carbono en estudio: producen una reacción ácida en ambos tipos de tubos. Fórmula (en gramos por litro) Tripteína 2. 0 Cloruro de sodio 5. 0 Fosfato dipotásico 0. 3 Agar 2. 50 Azul de bromotimol 0. 03 p. H final: 7. 1 ± 0. 1 1% de glucosa c-Microorganismos que no utilizan el hidrato de carbono en estudio: no producen cambios ninguno de los 2 tubos, los cuales permanecen verdes. Se debe informar: producción de ácido (A), ácido con gas (AG), o sin cambio (-).

b) Prueba de Rojo de Metilo Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona 7. 0 Glucosa 5. 0 Fosfato dipotásico 5. 0 p. H final: 6. 9 ± 0. 2

c) Prueba de Voges-Proskauer Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona 7. 0 Glucosa 5. 0 Fosfato dipotásico 5. 0 p. H final: 6. 9 ± 0. 2

d) Prueba de Citrato de Simmons (citrato permeasa) Fórmula (en gramos por litro) Citrato de sodio 2. 0 Cloruro de sodio Fosfato dipotásico Fosfato monoamónico Sulfato de magnesio Azul de bromotimol Agar 5. 0 1. 0 0. 2 0. 08 15. 0 p. H final: 6. 9 ± 0. 2

e) Prueba del TSI (Three Sugar Iron) Medio preparado es color rojo Resultados 1 -Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2 -Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3 -Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4 -La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5 -El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico. Fórmula (en gramos por litro) Extracto de carne 3. 0 Pluripeptona 20. 0 Cloruro de sodio 5. 0 Lactosa 10. 0 Sacarosa 10. 0 Glucosa 1. 0 Sulfato de hierro 0. 2 y amonio Tiosulfato de 0. 2 sodio Pico Fondo Rojo de fenol 0. 025 Agar 13. 0 p. H final: 7. 3 ± 0. 2

f) Prueba de la Caseinasa Fórmula (en gramos por litro) Triptona 5. 0 Dextrosa 1. 0 Extracto de carne 2. 5 Agar 15. 0 p. H final: 7. 0 ± 0. 2 1% de leche descremada

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