TRABAJO PRACTICO N 10 PAMELA SOLEDAD CUENCA CONTENIDOS

TRABAJO PRACTICO Nº 10 PAMELA SOLEDAD CUENCA

CONTENIDOS Velocidad de migración. Movilidad electroforética. Fundamentos y gráficos. Factores que influyen. Tipos de Electroforesis. Equipamiento y Aplicaciones en análisis genético. OBJETIVOS • • • Describir el fenómeno de electroforesis y las técnicas para producirla Discriminar los factores que influyen en la movilidad electroforética Justificar el uso de un campo eléctrico en el proceso de separación de biomoléculas

Fundamentos teóricos • • • Fue empleada por primera vez en 1937 por Teselius Es un método analítico- semipreparativo en el que se separan biomoléculas en dependencia entre otros factores de su carga y bajo la acción de un campo eléctrico. Consiste en la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico, produciendo la migración de las partículas hacia el ánodo o el cátodo (electrodos – y + ) en dependencia de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es un método de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad. Aporta un potente criterio de pureza. Permite evaluar las características acido básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo. Permite determinar peso molecular, punto isoelectrico y numero de cadenas polipeptídicas.

1 - Velocidad de migración: La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al efecto de su carga efectiva (q) y el gradiente del potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción f (relativo) según la forma y el tamaño de la partícula. v=q. E/f 2 - Movilidad electroforética: Es el caso particular de la migración de un ión cuando se aplica un campo de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga de la partícula. • la movilidad (u): es la velocidad que toma la partícula por unidad de campo. u= v / E = q / f (u) depende del coeficiente de fricción, que responde a parámetros físicos de la molécula, que pueden dar información del tamaño y forma de las moléculas.

La velocidad de migración depende de: Ø La densidad de carga (relación carga/peso) Ø Del voltaje aplicado. Si se aumenta se produce calentamiento. Si disminuye pobre separación por difusión prolongada Ø De la porosidad del gel. Ø p. H (otorga la carga neta de la partícula y puede modificarla) Ø Punto isoeléctrico: Por debajo la partícula tiene carga (+ ) y migra hacia el cátodo Por debajo la partícula tiene carga (–) y migra hacia el ánodo. 3 - Fundamentos y gráficos: Mezcla de moléculas ionizadas de q neta, sometidas a un campo eléctrico.

Sobre el movimiento de las moléculas actúan también dos fuerzas adicionales: • fricción con el solvente (dificulta el movimiento) • movimiento browniano (el movimiento molecular es aleatorio, por EK propia) La sumatoria de fuerzas provoca que las moléculas no migren de manera homogénea. Los iones comienzan a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente se puede utilizar un medio que oponga mas resistencia al movimiento como por ejemplo un gel. Entonces la migración será mas lenta pero el ensanchamiento del frente será reducido.

• Si se aumenta la intensidad del campo eléctrico, se puede acelerar la migración sin variar la difusión del frente, provocando que este sea mas compacto, esto mejora la definición del mismo. Esto esta limitado por la capacidad de la solución para disipar el calor generado por paso de la corriente eléctrica. • La presencia del gel hace que las moléculas de mayor tamaño sufran mayor resistencia al avanzar por los poros del gel que las moléculas mas pequeñas. • El solvente puede producir una fricción diferente sobre distintas moléculas, pero este efecto es despreciable cuando no existe el entramado del gel. 4 - Factores que influyen en la electroforesis: 1. El p. H: dentro de los electrolitos mas habituales es el Na. Cl o el TRIS-HCl, ambos presentan el ión Cl -, que tiene como consecuencia el aumento del p. H de la disolución, que aunque esta tamponada puede dañar la muestra. 2. El borato: este tampón no es del todo inerte y puede originar bandas desdobladas, correspondientes a una sola proteína, una pura y otra modificada por el borato. 3. El calentamiento: el gel se calienta debido al paso de la corriente eléctrica (efecto joule), esto puede desnaturalizar proteínas.

5 - Tipos de electroforesis ELECTROFORESIS Electroforesis convencional Electroforesis capilar E. capilar en gel E. capilar de Zona. Enfoque isoeléctrico Isotacoforesis

Electroforesis convencional: Ø Es muy utilizada para la detección, control de pureza, caracterización y cuantificación (por comparación controles), así como para la purificación y preparación de fragmentos de ADN Y ARN. Ø Se lleva a cabo sobre una capa delgada y placa de gel, semisólido y poroso que contiene un tampón en el interior de sus poros que ofrece resistencia al movimiento. Ø Se pueden separar varias muestras simultáneamente. Ø Se aplica un potencial de corriente continua por un tiempo fijo, transcurrido éste se corta la corriente. una vez que se produjo la separación de las especies se realiza la coloración para visualizarlas, Ø Se utilizan geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen entre sus ramificaciones espacios llenos de liquido. Esto permite la electroforesis: separación por relación carga/tamaño y el tamizado: separación por tamaño. Ø Los geles mas comunes son agarosa y poliacrilamida. Ø La concentración del gel define el poder de reticulación.

Electroforesis capilar (CE): Ø Surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta la intensidad del campo eléctrico aplicado Ø Se realiza electroforesis en un tubo capilar de menos de 0. 1 mm de diámetro y 50 a 100 cm. de longitud Ø Reduce el efecto Joule aumentando la disipación del calor generado Ø El mecanismo de separación esta basado en la relación carga/masa Ø Se utilizan volúmenes pequeños de 0, 1 a 10 n. L. , con una elevada resolución y rapidez.

Tipos de CE. : Ø Electroforesis capilar en gel Ø E. Capilar de zona Ø Enfoque isoeléctrico Ø Isotacoforesis

Electroforesis capilar en gel ØCombina la técnica de electroforesis con la cromatografía de reparto. ØSeparación en función de la migración electroforética y el peso molecular. ØSe lleva a cabo en la matriz polimérica de un gel poroso contenido en un tubo capilar

E. Capilar de zona ØBasada en la separación de analitos según la relación carga/tamaño. ØLa composición del tampón es constante en toda la zona de separación. ØLos componentes de la mezcla migran cada uno según su propia movilidad y se separan en zonas que pueden estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. ØNo permite separar compuestos neutros

Enfoque isoeléctrico ØSe basa en establecer un gradiente de p. H estable en una disolución o gel. ØEste gradiente se logra por un conjunto de anfolitos que migran hasta alcanzar sus puntos isoeléctricos. ØCuando en el gradiente de p. H se introduce una proteína, cada zona intercambia protones con la muestra proteica generando una separación isoeléctrica.

Isotacoforesis ØElectroforesis a velocidad uniforme tiempo transcurrido en el capilar bajo condiciones isotacóforeticas es independiente de la velocidad. ØSe basa en la separación por desplazamiento. ØEl capilar se debe llenar de un electrolito líder, éste debe tener una gran movilidad, mayor a la de los componentes a separar, luego se introduce un electrolito terminal, de movilidad menor a la muestra.

ELECTROFORESIS: • Es el movimiento de partículas cargadas (micelas o iones coloidales) a través de su medio de dispersión sometidas a un campo eléctrico. • Algunos autores prefieren el termino de ionoforesis para designar la migración de iones pequeños. • En bioquímica clínica la migración electroforética se utiliza para aislar los principales grupos de proteínas del suero, y a veces de la orina, para reconocer cambios en las concentraciones relativas y para identificar proteínas anormales. • Dicha migración electroforética, corrientemente es estudiada en soportes o sustratos diversos como ser papel de filtro, agarosa, acetato de celulosa, gel de almidón, gel de poliacrilamida etc. Embebidas en soluciones buffers.

6 - Equipamiento y aplicaciones al análisis genético. En el comercio existen distintos aparatos para electroforesis que constan de una fuente de poder y una cámara de separación.

FUENTE DE PODER: La corriente eléctrica es suministrada por una fuente rectificadora de onda completa que transforma la corriente alternada de 220 V y 50 ciclos por segundo en corriente contínua purificada. CÁMARA DE SEPARACIÓN: Las cubas electroforéticas consisten en cubetas de poliestireno tabicadas con planchas de poliestireno de alto impacto y electrodos de platino.

Equipamiento y aplicaciones al análisis genético.

Equipos modernos:

PROTEÍNOGRAMA Análisis de proteínas plasmáticas en suero humano utilizando electroforesis en papel de celulosa El objetivo de esta técnica es poder analizar de forma rápida la presencia de proteínas plasmáticas que podemos encontrar en una muestra de suero sanguíneo, mediante un método bioquímico, basado en reacciones enzimáticas. Además este método nos permite cuantificarlas.

üEl método consiste en obtener las proteínas presentes en el suero sanguíneo humano. üSe lo somete a una electroforesis para lograr la migración de las proteínas que será diferencial dependiendo esta diferencia de la carga eléctrica de la proteína. üPosteriormente, teñiremos, y valoraremos los resultados.

Marco teórico: 1. Preparación de la muestra: 2. La sangre entera, esta compuesta de agua, proteínas, electrolitos y células o elementos formes como las células blancas que son los encargados de la defensa, las plaquetas encargadas de la coagulación, y los hematíes o eritrocitos (células rojas), encargados de transportar el O 2 a los tejidos. El suero (porción líquida de la sangre que contiene a los electrolitos, agua y proteínas) se obtiene dejando coagular la sangre entera, unos minutos en un tubo de ensayo. Luego se divisaran dos fases, un decantado (coágulo) que corresponde a la fase semisólida celular. El sobrenadante (suero) se extrae con una pipeta Pasteur.

2. Descripción de las proteínas plasmáticas: Albúmina Globulina Alfa 1 Globulina alfa 2 Globulina Beta Globulina gamma

ALBUMINA • La albúmina (PM de 69. 000) es una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre y a su vez la más abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hígado. • La concentración normal en la sangre humana oscila entre 3, 5 y 5, 0 gramos por decilitro, y supone un 54, 31% de la proteína plasmática • La albúmina tiene carga eléctrica negativa. La membrana basal del glomérulo renal, también está cargada negativamente, lo que impide la filtración glomerular de la albúmina a la orina. En el síndrome nefrótico, esta propiedad es menor, y se pierde gran cantidad de albúmina por la orina.

Tipos de albúmina Seroalbúmina: Es la proteína del suero sanguíneo. Ovoalbúmina: Es la albúmina de la clara del huevo. Lactoalbúmina: Es la albúmina de la leche. Causas de la deficiencia de albúmina Cirrosis hepática: Por disminución en su síntesis hepática. Desnutrición. Síndrome nefrótico: Por aumento en su excreción. Trastornos intestinales: Pérdida en la absorción de aminoácidos durante la digestión y pérdida por las diarreas. Enfermedades genéticas que provocan hipoalbuminemia, que son muy raras.

GLOBULINAS: • Las globulinas son un grupo de proteínas insolubles en agua que se encuentran en todos los animales y vegetales. • Entre las globulinas más importantes destacan las seroglobulinas (de la sangre), las lactoglobulinas (de la leche), las ovoglobulinas (del huevo), la legúmina, el fibrinógeno, los anticuerpos (α-globulinas) y numerosas proteínas de las semillas. • Las globulinas son un importante componente de la sangre, específicamente del plasma. Éstas se pueden dividir en varios grupos.

Principales grupos de globulinas -globulinas alfa 1 y 2 -globulinas beta -globulina gamma Algunas de las siguientes globulinas se clasifican como "reactivo de fase aguda". Esto quiere decir que son proteínas que van a aumentar o disminuir su concentración en el plasma, a partir de los procesos inflamatorios o infecciosos. Y que van a servir para determinar ciertas patologías. La concentración promedio de las alfa globulinas en sangre es de 1, 5 g/dl, mientras que la concentración de albumina es aproximadamente 4, 2 g/dl y la de las demás proteínas séricas, menor que 0, 5 g/dl.

ALFA GLOBULINAS: • Las alfa globulinas son un grupo de globulinas circulantes en el plasma sanguíneo y que se caracterizan por tener mobilidad eléctrica en soluciones alcalinas o soluciones cargadas. Tienen la peculiaridad funcional de inhibir ciertas proteasas sanguíneas. • alfa 1 globulinas: las mas importantes son la alfa -1 antitripsina y la globulina fijadora de tiroxina; • alfa 2 globulinas: que contiene la haptoglobulina, ceruloplasmina, HDL, angiotensinógeno y alfa-2 macroglobulinas.

GLOBULINAS BETA: • Las beta globulinas son un grupo de globulinas circulantes en el plasma sanguíneo y que se caracterizan por tener cierta mobilidad eléctrica en soluciones alcalinas o soluciones cargadas, donde son más migratorias que las gamaglobulinas pero menos que las alfa globulinas. Estas proteínas han sido medidos en mamíferos y otros animales como las ranas.

Tipos Las principales proteínas sanguíneas son la albúmina y las globulinas, las cuales son más pequeñas y menos numerosas que la albumina. Las globulinas se dividen en alfa, beta y gamaglobulinas. Algunos ejemplos de beta globulinas son: angiostatinas beta-2 microglobulina plasminógeno properdina globulina fijadora de hormona sexual transferrina. . . un transportador de hierro. La concentración promedio de las beta globulinas en sangre es menor que 0, 5 g/dl

GAMMA GLOBULINAS: • Corresponden a las inmunoglobulinas séricas o anticuerpos (Ig. A, E, G, M). • Pueden encontrarse de forma soluble en la sangre o en otros fluidos corporales de los vertebrados, disponiendo de una forma idéntica que actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraños tales como bacterias, virus o parásitos. • En general, se considera que anticuerpo e inmunoglobulina son sinónimos, haciendo referencia el primer término a la función, mientras que el segundo alude a la estructura. El término gammaglobulina se debe a las propiedades electroforéticas de las inmunoglobulinas solubles en suero. • La fracción de las gammaglobulinas supone entre 10. 3 y 20. 8% del • total de proteínas del suero.

Protocolo de laboratorio: Reactivos: Solución buffer: Buffer Borato-Acetato p. H=8. 6 Solución colorante: Negro Amido: Amidoschwartz……. 0. 5 g. Alcohol metílico……. 45 ml Agua destilada……. . . 45 ml Ácido acético………. . 10 ml

Líquido Lavado: • Alcohol metilico……. 250 ml…. 62. 5 ml • Agua destilada……. . . 225 ml… 56. 25 ml • Ácido acético………. . 25 ml…. . 6. 25 ml Líquido de Elución: • Alcohol metilico……. 50% • Agua destilada……. . 50% Líquido de transparentización: • Alcohol metilico……. 16 ml • Ácido acético………. 4 ml

Conservación de las tiras de cellogel: Se trasvasan las tiras de cellogel a otro envase que cierre herméticamente y que contenga metanol al 40%. Estas tiras deben permanecer siempre en medio liquido ya que si se secan al aire pierden sus dimensiones y su estado de gelidificación, dejando de ser útiles para la electroforesis. Deben manejarse con pinzas tomándolas de los extremos teniendo la precaución de no estirarlas ni romperlas.

La tira de cellogel presenta un lado con la superficie mas opaca que es el de la parte superior y es en el que se realiza la siembra de la muestra, y otro mas brillante que se sitúa en el lado inferior.

APLICACIÓNDEL SUERO: • Puede hacerse con los mas variados dispositivos que presentan bordes completamente lisos para no rasgar la superficie de la tira y que permiten depositar escasa cantidad de suero. • La mejor forma de depositar el suero es mediante aplicadores que se fabrican comercialmente y que consisten en una pieza horizontal que lleva en un punto una guía para que se deslice a través de otra pieza en forma vertical y que hace el movimiento de ascenso y de descenso.

Técnica: 1. Unos 10 o 15 minutos antes de utilizar las tiras de cellogel se las suspenden en un recipiente que contenga la solucion buffer. 2. Se remueve el exceso de liquido entre dos hojas de papel absorbente. 3. Se procede a la siembra del suero, colocándolo de una manera quede a dos cm. del cátodo. Y de tal modo que la cara mate quede hacia arriba Cuando se realiza la siembra, con el hansa de 3 microlitros, se debe tener la consideración de que esta no tiene que estar sobre cargada y además no debe efectuarse mucha presión sobre el cellogel. 4. . Se extiende sobre el soporte de la cuba electroforética, la misma debe quedar tensa y plana. 5. Se lleva el soporte a la cubeta teniendo en cuenta que los extremos de las tiras deben tener contacto con el buffer de la cuba. Se conecta el aparato con un voltaje fijo de 200 V por aproximadamente 30 minutos.

6. Una vez finalizada la electroforesis, se deja escurrir la tira sin secar y se sumerge en la solución colorante durante 5 minutos. Seguidamente se lava 3 a 4 veces con el liquido de lavado. 7. Una vez que el lavado se termino, se procede a colocar el eluyente, y por ultimo se procede al transparentado, el cual permite otorgar a el cellogel un aspecto transparente. Para posterior secado en estufa a 60ºC por 3 minutos. 8. Después se procede a la determinación cuantitativa cortando las fracciones coloreadas e introduciéndolas en tubos de ensayos preparados en serie de 5. se coloca a cada tubo 3 ml del eluyente. Se lee en fotocolorimetro a 620 nm. O bien por medio de un densímetro que permite cuantificar las proteínas además de graficarlas en función de su concentración en suero.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: • • • En el estudio general de las variaciones del proteinograma se deben tener en cuenta las variaciones en mas (hiperproteinemias) o en menos ( hipoproteinemias, de la proteinemia total, y de las diferentes fracciones proteicas que integran el proteinograma. Todas las hiperproteinemias son debidas a un gran aumento de las globulinas y las hipoproteinemias a un descenso de la albúmina. Los valores normales de las proteínas plasmáticas son las siguientes: siguientes PROTEINAS g/100 ml % relativos Proteínas totales 6 a 8 Albúmina 3. 6 a 5. 2 60 a 65 Globulina alfa 0. 24 a 0. 64 4 a 8 Globulina beta 0. 42 a 0. 80 7 a 10 Globulina gamma 1. 08 a 1. 60 18 a 20

VARIACIÓN DE LA PROTEINEMIA TOTAL VARIACIÓN DE LAS FRACCIONES Albúmina baja y gran aumento de globulina. Hiperproteinemia Aumento de Gβ: plasmocitoma y macroglobulinemia. Aumento de Gγ: plasmocitoma, macroglobulinemia, kalaazar, linfogranuloma, cirrosis esplenomegálicas y endocarditis lenta abacteriana. Albúmina baja y aumento de la Gα y discreto de Gγ Variación ligera o nula de la proteinemia total Hipoproteinemia PROCESOS TÍPICOS A QUE CORRESPONDEN Albúmina baja, aumento dominante de Gγ y a veces ligero de Gβ Inflamaciones, infecciones agudas y subagudas. Neoplasias. Hepatitis, cirrosis hepàtica e infecciones crónicas. Albúmina baja y aumento discreto de Gα, Gβ y Gγ Neoplasias. Albúmina muy baja, aumento de Gα 2 y Gβ. Gγ normal o disminuida. Nefrosis. Albúmina muy baja y aumentos nulos o discretos de Gα, Gβ y Gγ Neoplasias digestivas, esteatorreas, enfermedades consuntivas y carenciales Albúmina muy baja y aumentote Gγ Cirrosis hepaticas de larga evolución, infecciones crónicas consuntivas.

Geles de electroforesis

Salting out de DNA • Esta técnica consiste en la purificación de DNA para someterla a una posterior electroforesis. En la imagen se observa DNA en estado de cromatina en suspensión de isopropanol.

Gel de agarosa – Muestra: ADN • En cada pocillo se ha corrido una muestra de ADN. Como se trata de moléculas de gran tamaño migran lentamente. Muestras de diferentes extracciones A 1 A 2 A 3 A 4 B 1 B 2 B 3 B 4 C 1 C 2 C 3 C 4

Gel de agarosa - PCR • En cada pocillo se han depositado 10 ul de una PCR. Se separan fragamentos de pequeño tamaño por lo que la migración es mayor. 1: Control negativo 2: PCR 1 3: PCR 2

Gel de poliacrilamida – muestra PCR • Se separan los amplicones producto de una PCR. El método de revelado es mas sensible. M PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4

Gel de poliacrilamida – Muestra proteínas • Se separan muestras de proteínas extracelulares que migran en un gel de PAGE desnaturalizante. Se separan por masa. Tinción con plata. M Diferentes extractos de hongos Cada banda corresponde con tamaños diferentes

Revelado de los resultados

Bioinformática: Simulación de electroforesis. Esta miniaplicación (applet) simula el proceso de electroforesis de las proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS. Tras la separación, se puede obtener un gráfica con los resultados. En ésta, se determina la masa molecular experimental de las muestras a partir de su movilidad comparada con la de los patrones. http: //biomodel. uah. es/lab/sds-page/inicio. htm http: //biomodel. uah. es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof 2. html