Theoretical study for the treatment of Alzheimers disease

Theoretical study for the treatment of Alzheimer's disease with combined therapy: development and innovation Carolina Guerrero, Samuel Takvor, Jesús Frutos y Víctor Lombardo

ÍNDICE 1 Introducción 2 Enfermedad de Alzheimer − Enfermedades neurodegenerativas − Alzheimer − Factores de riesgo − Epidemiología − − − Hipótesis Antecedentes Diana seleccionada 3 Diseño teórico-experimental 4 Resultados esperados 5 Conclusión

INTRODUCCIÓN Enfermedades neurodegenerativas Hoy en día las enfermedades neurodegenerativas suponen un grave problema, ya que no existen tratamientos efectivos. Estas patología requieren un elevado gasto de coste sanitario. Como consecuencia del aumento de la esperanza de vida este grupo de enfermedades es cada vez mayor Alzheimer El Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que afecta al SNC cuya etiología no se conoce. Se caracteriza por una pérdida progresiva hasta una amnesia total. Actualmente no se ha conseguido un avance en cuanto a su diagnóstico

INTRODUCCIÓN Factores de riesgo Están implicados varios factores que pueden inducir y acelerar el desarrollo del Alzheimer, pero los principales factores son la edad ya que esta enfermedad afecta en especial a personas mayores, a mayor edad mayor incidencia; estrés y predisposición genética.

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Hipótesis colinérgica Niveles bajos de acetilcolina en las hendiduras presináptica de las neuronas colinérgicas. Alta actividad de la acetilcolinesterasa o deficiencia acetilcolina Hipótesis Amiloide Acumulación del péptido β-amiloide formando placas amiloides. APP procesado de dos formas: vía amiloidogénica y no amiloidogénica Hipótesis Tau Relacionada con el grado de fosforilación de Tau. Desactivación de la fosfatasa, induce una hiperfosforilación formando autoagregados, pares de filamentos helicoidales (PHF), componente de los ovillos neurofibrilares.

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Posibles dianas abordadas 1. Tau 1. 1. Inhibir agregación de Tau fosforilada (inflamación) 1. 2. Sobreactivación fosfatasa PP 2 A (inespecificidad y más sencillo inhibir) 1. 3. Disminuir actividad GSK 3 -β ▪ Inhibir ATP competitivo (causa toxicidad) ▪ Inhibidor ATP no competitivo 2. β-amiloide 2. 1. Sobreactivación α-secretasa (más sencillo inhibir) 2. 2. Inhibir γ-secretasa (actúa en procesos fisiológicos) 2. 3. Anticuerpo (provoca inflamación con tej. Neuronal) 2. 4. Inhibidores competitivos (toxicidad) 2. 5. Activación de reticulón (Inhibidor natural de β-secretasa, proteína poco estudiada) 2. 6. Emplear péptidos análogos del reticulón

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Posibles dianas abordadas 1. Tau 1. 1. Inhibir agregación de Tau fosforilada (inflamación) 1. 2. Sobreactivación fosfatasa PP 2 A (inespecificidad y más sencillo inhibir) 1. 3. Disminuir actividad GSK 3 -β ▪ Inhibir ATP competitivo (causa toxicidad) ▪ Inhibidor ATP no competitivo 2. β-amiloide 2. 1. Sobreactivación α-secretasa (más sencillo inhibir) 2. 2. Inhibir γ-secretasa (actúa en procesos fisiológicos) 2. 3. Anticuerpo (provoca inflamación con tej. Neuronal) 2. 4. Inhibidores competitivos (toxicidad) 2. 5. Activación de reticulón (Inhibidor natural de β-secretasa, proteína poco estudiada) 2. 6. Emplear péptidos análogos del reticulón

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

OBJETIVO Desarrollo y demostración de la eficacia de la terapia combinada compuesta por un inhibidor ATP no competitivo de GSK 3 -β y un péptido análogo del reticulon 3 Centro activo de BACE 1

DISEÑO Diseño teórico-experimental 1. Química combinatoria→ péptidos de 20 aa =250 péptidos 1. 1. Síntesis asistida por polímeros SOPS (matriz en fase sólida) 2. Ensayo de cribado 2. 1. Ensayo FRET (Cyan-Yellow) - Placa 384: Péptido + BACE - (APP+ ab (fluorescente) -- ab 2 (fluorescente) reconoce corte Glu-Val-Asn-Leu//Asp-Ala-Glu-Phe) 2. 2. Ensayo PAMPA endotelial (Control (VIP) + péptidos) - Péptido solo - Péptido con liposoma + transferrina (tropismo cerebro) - Péptido con proteína viral 2. 3. Ensayo celular→ SH-SY 5 Y línea neuronal humana que sobreexpresa b-amiloide → control, tideglusib+ péptido (liposoma/ proteína vírica) - Uso Quantum dots para APP, p-Tau, Tau 2. 4. Ensayo animal→ modelo APP-Tg mouse model APP 23 → Ensayos de comportamiento y láminas cerebrales - Control - Solo inhibidor ATP no competitivo (Tideglusib) - Solo péptido con liposoma/ proteína viral - Péptido + tideglusib - Quantum dots

DISEÑO Diseño teórico-experimental 1. Química combinatoria→ péptidos de 20 aa =250 péptidos 1. 1. Síntesis asistida por polímeros SOPS (matriz en fase sólida) 2. Ensayo de cribado 2. 1. Ensayo FRET (Cyan-Yellow) - Placa 384: Péptido + BACE - (APP+ ab (fluorescente) -- ab 2 (fluorescente) reconoce corte Glu-Val-Asn-Leu//Asp-Ala-Glu-Phe) 2. 2. Ensayo PAMPA endotelial (Control (VIP) + péptidos) - Péptido solo - Péptido con liposoma + transferrina (tropismo cerebro) - Péptido con proteína viral 2. 3. Ensayo celular→ SH-SY 5 Y línea neuronal humana que sobreexpresa b-amiloide → control, tideglusib+ péptido (liposoma/ proteina vírica) - Uso Quantum dots para APP, p-Tau, Tau 2. 4. Ensayo animal→ modelo APP-Tg mouse model APP 23 → Ensayos de comportamiento y láminas cerebrales - Control - Solo inhibidor ATP no competitivo (Tideglusib) - Solo péptido con liposoma/ proteína viral - Péptido + tideglusib - Quantum dots

DISEÑO Diseño de péptidos • Consideramos que la mejor opción es sintetizar un péptido análogo al dominio RHD de RTN-3. • Sin embargo, este dominio consta de 235 -250 aminoácidos, lo cual un péptido de tamaño completo hace inviable su introducción en un organismo vivo y su éxito terapéutico (no atravesarían la BHE). Por ello, decidimos fragmentar el RHD en péptidos de 20 aminoácidos con la intención de que alguno de ellos interaccione con BACE-1 en su sitio alostérico. • Se diseñan los péptidos dividiendo el dominio RHD en péptidos de 20 aminoácidos realizando todas las combinaciones posibles alterando el marco de lectura, generando una colección de 250 péptidos. Dominio RHD

DISEÑO Síntesis asistida por matriz sólida • La fase sólida (FS) es un polímero insoluble de alto peso molecular, al que se le añade un linker, una molécula que posee un grupo funcional que evita que se agregue el péptido que sintetizaremos a la matriz. • Con reacciones sucesivas conseguiremos sintetizar nuestro péptido • La primera reacción se basa en aprovechar el grupo funcional del linker. Posteriormente, sabiendo el aminoácido queremos unir en cada caso, emplearemos reacciones bien estipuladas en la bibliografía, hasta conseguir cada péptido análogo. • El último paso se basa en un corte específico para separar el péptido del linker (subida de p. H, corte, centrifugación y filtración).

MATERIALES Y MÉTODOS Diseño teórico-experimental 1. Química combinatoria→ péptidos de 20 aa =250 péptidos 1. 1. Síntesis asistida por polímeros SOPS (matriz en fase sólida) 2. Ensayo de cribado 2. 1. Ensayo FRET (Cyan-Yellow) - Placa 384: Péptido + BACE - (APP+ ab (fluorescente) -- ab 2 (fluorescente) reconoce corte Glu-Val-Asn-Leu//Asp-Ala-Glu-Phe) 2. 2. Ensayo PAMPA endotelial (Control (VIP) + péptidos) - Péptido solo - Péptido con liposoma + transferrina (tropismo cerebro) - Peptido con proteina viral 2. 3. Ensayo celular→ SH-SY 5 Y línea neuronal humana que sobreexpresa b-amiloide → control, tideglusib+ péptido (liposoma/ proteina vírica) - Uso Quantum dots para APP, p-Tau, Tau 2. 4. Ensayo animal→ modelo APP-Tg mouse model APP 23 → Ensayos de comportamiento y láminas cerebrales - Control - Solo inhibidor ATP no competitivo (Tideglusib) - Solo péptido con liposoma/ proteína viral - Péptido + tideglusib - Quantum dots

DISEÑO Ensayo FRET (Cyan-Yellow) • BACE: Beta secretasa • APP: Amiloid precursor protein • Anticuerpo Cyan: Cterminal APP • Anticuerpo Yellow: Sitio de corte BACE Péptido inhibidor Péptido no inhibidor

DISEÑO Ensayo FRET (Cyan-Yellow) BACE inhibida. Se da el fenómeno de FRET, observando fluorescencia amarilla, ya que el Ac conjugado con YFP reconoce la secuencia de corte y APP no ha sido escindida. Estos péptidos son los llamados “hits”

MATERIALES Y MÉTODOS Diseño teórico-experimental 1. Química combinatoria→ péptidos de 20 aa =250 péptidos 1. 1. Síntesis asistida por polímeros SOPS (matriz en fase sólida) 2. Ensayo de cribado 2. 1. Ensayo FRET (Cyan-Yellow) - Placa 384: Péptido + BACE - (APP+ ab (fluorescente) -- ab 2 (fluorescente) reconoce corte Glu-Val-Asn-Leu//Asp-Ala-Glu-Phe) 2. 2. Ensayo PAMPA endotelial (Control (VIP) + péptidos) - Péptido solo - Péptido con liposoma + transferrina (tropismo cerebro) - Péptido con proteína viral 2. 3. Ensayo celular→ SH-SY 5 Y línea neuronal humana que sobreexpresa b-amiloide → control, tideglusib+ péptido (liposoma/ proteina vírica) - Uso Quantum dots para APP, p-Tau, Tau 2. 4. Ensayo animal→ modelo APP-Tg mouse model APP 23 → Ensayos de comportamiento y láminas cerebrales - Control - Solo inhibidor ATP no competitivo (Tideglusib) - Solo péptido con liposoma/ proteína viral - Péptido + tideglusib - Quantum dots

DISEÑO Ensayo PAMPA/Transwell BHE In vivo Endotelio capilar Pericitos Astrocitos BHE In vitro Para evaluar la capacidad del los péptidos seleccionados de atravesar la BHE (solubilidad y permeabilidad), se diseñan ensayos PAMPA/ Transwell simulando la BHE In vitro, mediante el cultivo de células de varios tipos (endoteliales, pericitos y astrocitos) separadas en dos compartimentos. El ensayo se basa en medir la cantidad de péptido de cada tipo que ha sido capaz de pasar al compartimento inferior.

DISEÑO Ensayo PAMPA/Transwell transferrina Liposomas (transferrina) + péptidos PRNP + péptidos En este ensayo PAMPA/Transwell se evaluarán distintos métodos para mejorar la solubilidad y permeabilidad de los péptidos por sí solos: • En uno de ellos, se evaluará si el recubrimiento de los péptidos con liposomas recubiertos de transferrina (descubiertos en el MIT en 2019) mejora el tropismo por la BHE, así como el paso a su través. • En el otro, se añadirá el péptido recubierto con una proteína priónica que mejore el tropismo por el cerebro

MATERIALES Y MÉTODOS Diseño teórico-experimental 1. Química combinatoria→ péptidos de 20 aa =250 péptidos 1. 1. Síntesis asistida por polímeros SOPS (matriz en fase sólida) 2. Ensayo de cribado 2. 1. Ensayo FRET (Cyan-Yellow) - Placa 384: Péptido + BACE - (APP+ ab (fluorescente) -- ab 2 (fluorescente) reconoce corte Glu-Val-Asn-Leu//Asp-Ala-Glu-Phe) 2. 2. Ensayo PAMPA endotelial (Control (VIP) + péptidos) - Péptido solo - Péptido con liposoma + transferrina (tropismo cerebro) - Péptido con proteína viral 2. 3. Ensayo celular→ SH-SY 5 Y línea neuronal humana que sobreexpresa b-amiloide → control, tideglusib+ péptido (liposoma/ proteina vírica) - Uso Quantum dots para APP, p-Tau, Tau 2. 4. Ensayo animal→ modelo APP-Tg mouse model APP 23 → Ensayos de comportamiento y láminas cerebrales - Control - Solo inhibidor ATP no competitivo (Tideglusib) - Solo péptido con liposoma/ proteína viral - Péptido + tideglusib - Quantum dots

DISEÑO Ensayos celulares + Vector Línea SH-SY 5 Y (neuronas dopaminérgicas humanas) Lentivirus Tamoxifeno El siguiente paso consistirá en realizar ensayos celulares. Nuestro interés radica en emplear una línea de neuronas humanas que sobreexpresen APP. La línea elegida es la SH-SY 5 Y, una línea comercial estable de neuronas dopaminérgicas humanas provenientes de neuroblastoma. La sobreexpresión de APP se logrará mediante la transfección con lentivirus y la introducción de un vector cuya expresión sea inducible, por agentes como el tamoxifeno.

DISEÑO Ensayos celulares Línea SH-SY 5 Y (neuronas dopaminérgicas humanas) Quantum Dots Ácido okadaico Microscopía confocal Tras seleccionar aquellos péptidos que han tenido actividad inhibidora de BACE-1, se realiza el mismo ensayo celular con la línea anteriormente empleada. En todos los grupos se emplearán los Quantum Dots, nanopartículas con un núcleo de Zinc y Cadmio que nos permitirán observar los niveles Se realizan 4 grupos de ensayo: un grupo control, un grupo con cada uno de los péptidos análogos que han ido pasando las pruebas anteriores, un grupo de APP, Tau y p-Tau. Para ello, se les conjugará un anticuerpo a estas partículas mediante un linker y se medirá por microscopía confocal la con el inhibidor de GSK 3 b al que se añade además ácido ocadaico, un agente fijador de neuronas que permite la entrada del inhibidor de GSK-3. Este fluorescencia obtenida. ensayo es necesario para seleccionar los péptidos que realmente posean sinergia con el inhibidor de GSK-3 y no produzcan un efecto contrario, y un grupo con cada péptido análogo con el inhibidor añadiendo de nuevo el ácido ocadaico

DISEÑO Ensayos celulares Línea SH-SY 5 Y (neuronas dopaminérgicas humanas) Se seleccionarán aquellos péptidos en los cuales se dé un aumento de APP y Tau, y que provoquen una disminución de p. Tau. Además, se realizarán Western-Blots complementarios para medir los niveles de Tau soluble e insoluble de manera cualitativa y comprobar los datos obtenidos Ensayo complementario Tau soluble WB Tau agregada

DISEÑO Ensayos animales Toxicidad Efectividad Ratones APP 23 (“APP-Tg mouse model”) Quantum Dots Péptidos desnudos Liposomas + transferrina Péptidos + proteína priónica A continuación, se realizarán ensayos en animales de experimentación para comprobar la toxicidad y efectividad de los Asimismo, para favorecer la absorción de los péptidos y el paso por la barrera hematoencefálica, se administrarán los leads seleccionados. Para ello se escogerá el modelo de ratón APP 23 (“APP-Tg mouse model”), el cual es un modelo compuestos desnudos, introducidos en liposomas recubiertos de transferrina o con partículas virales con un tropismo comercial capaz de expresar el APP humano de manera inducible. Con el empleo de los Quantum Dots frente a APP, Tau por el tejido nervioso. y p-Tau, se analizarán los niveles de dichas proteínas tras introducir la mezcla del inhibidor de GSK-3 y el péptido Posteriormente, se sacrificarán los animales y se analizará su corteza cerebral mediante los QD, observando el efecto in vivo de la terapia combinada previo al ensayo clínico en humanos de fase I análogo de RTN-3, de manera oral o intravenosa. Microscopía confocal

RESULTADOS ESPERADOS 1. Inhibir la formación de ovillos neurofibrilares (NFTs) y de placas amiloides mediante terapia combinada 2. Demostrar la efectividad de la terapia “multi-target” 1. Paliar los efectos de pérdida de memoria y neurodegeneración progresivos característicos de la patología 2. Mejorar la calidad de vida de los pacientes

PLANIFICACIÓN FASE CLÍNICA Forma de administración (oral, intravenosa, …) Posible empleo de excipientes Planificación de grupos de estudio Reclutamiento de pacientes, personal y centros Seguimiento de la evolución

Gracias por vuestra atención