THC HNH HA SINH I CNG NI DUNG

THỰC HÀNH HÓA SINH ĐẠI CƯƠNG

NỘI DUNG • I. THỰC NGHIỆM VỀ PROTEIN – 1. 1. Các phản ứng màu – 1. 2. Khảo sát một số lý tính của protein • II. THỰC NGHIỆM VỀ ENZYME – 2. 1. Phản ứng Tromer – 2. 2. Thủy phân tinh bột bởi amylase – 2. 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme – 2. 4. Ảnh hưởng của p. H đến hoạt tính của enzyme – 2. 5. Tính đặc hiệu của enzyme

I. THỰC NGHIỆM VỀ PROTEIN 1. 1. Các phản ứng màu Phản ứng Biure Phản ứng Xanthoprotein

Phản ứng Biure • Nguyên lý: – Trong môi trường kiềm, các chất chứa từ hai liên kết peptide trở lên sẽ tạo phức chất màu tím hồng với Cu++ (muối của đồng).

Phản ứng Biure

Các bước tiến hành • Lấy 0. 1 g ure • Đun nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn • Để nguội thu được Biure

1 2 3 4 • • 1: Biure 2: 1 ml lòng trắng trứng 3: 1 ml sữa tươi 4: 1 ml gelatin 1% Cho vào cả 4 ống 1 ml Na. OH 10% Cho vào cả 4 ống 1 2 giọt Cu. SO 41% Lắc đều so sánh màu và giải thích kết quả

? ? ? ? ? 1 2 3 4 • Ứng dụng: – Phát hiện protein – Định lượng protein

Phản ứng Xanthoprotein • Nguyên lý: • C¸c protein cã chøa aa m¹ch vßng nh : Phe, Tyr, Trp, … d íi tác dụng cña HNO 3 ®Æc, bị nitơ hóa màu vàng, nÕu gÆp m «i tr êng kiÒm m¹nh muèi cã màu da cam.

Các bước tiến hành 1 2 3 • • • 1: 1 ml lòng trắng trứng, 1 ml HNO 3 đặc 2: 1 ml sữa tươi, 1 ml HNO 3 đặc 3: 1 ml gelatin 1%, 1 ml HNO 3 đặc Đun trªn ®Ìn cån mµu vµng. ĐÓ nguéi. Cho tõ tõ tõng giät Na. OH 20% (khoảng 1 2 ml) mµu vµng da cam.

? ? ? ? ? 1 2 3 • Nhận xét và giải thích kết quả • Ứng dụng: – Phát hiện protein – Kiểm tra chất lượng protein

1. 2. CÁC PHẢN ỨNG SA LẮNG PROTEIN Phương pháp diêm tích Sa l¾ng b» ng cån Sa l¾ng bëi nhiÖt ®é cao

Phương pháp diêm tích • Nguyên lý: – Diªm tÝch lµ ph ¬ng ph¸p dïng c¸c muèi nh : Na. Cl, (NH 4)2 SO 4. . . ®Ó kÕt tña protein. Nguyªn nh©n kÕt tña lµ do c¸c tiÓu phÇn protein bÞ trung hßa ®iÖn tÝch bởi các ion. C¸c protein kh¸c nhau sÏ tña ë những nång ®é muèi kh¸c nhau. Vì vËy cã thÓ t¸ch riªng c¸c protein ra khái hçn hîp. • Ứng dụng: – ChiÕt suÊt c¸c protein ho¹t tÝnh.

Các bước tiến hành 1 -3 ml lòng trắng trứng -3 ml (NH 4)2 SO 4 bão hòa -Lọc sang ống 2 2 - Cho tinh thể (NH 4)2 SO 4 đến khi dd bão hòa - Để 5 phút, lọc sang ống 3 3 - Thử phản ứng Biure

Sa lắng bằng cồn • Nguyên lý: – Protein bÞ kÕt tña b «ng hoÆc vÈn trong dung m «i h/c¬ nh : cån, aceton, eter, . . . Do protein bÞ mÊt líp vá thñy hãa – Tña cµng dÔ nÕu cã thªm Na. Cl. – KÕt tña b» ng cån cã thÓ lµ kÕt tña thuËn nghÞch nÕu tiÕn hµnh ë nhiÖt ®é thÊp (00 ®Õn – 150 C) vµ tña ® îc t¸ch khái cån mét c¸ch nhanh chãng. • Ứng dụng: – Dïng cån s¸t trïng – T¸ch chiÕt enzyme

Các bước tiến hành 1 -1 ml cồn 960 -1 ml lòng trắng trứng 2 3 - 1 ml cồn 960 - 1 ml côn 960 - 1 -2 giọt Na. CL bão hòa -1 ml lòng trắng trứng -1 ml dung dịch gelatin 1% Nhận xét và giải thích kết quả

Sa l¾ng bëi nhiÖt ®é cao • Nguyªn lý: – Protein khi bị ®un nãng sÏ bÞ x¸o trén vÒ mÆt cấu truc ph©n tö, mÊt líp vá thñy hãa nªn mÊt tÝnh hßa tan vµ bÞ ® «ng vãn. HiÖn t îng nµy xảy ra m¹nh ë ®iÓm ®¼ng ®iÖn. – NÕu sù biÕn tÝnh nµy xảy ra ë p. H kh¸c nhau (trong m «i tr êng kiÒm m¹nh, hoÆc acid m¹nh), protein vÉn ë tr¹ng th¸i tÝch ®iÖn nªn kh «ng bÞ ® «ng vãn mµ ë d¹ng dung dÞch. • Ứng dụng: – Dïng nhiÖt ®é cao ®Ó hÊp, sÊy nhằm tiÖt trïng c¸c dông cô

Các bước tiến hành 1 2 3 4 5 Cho vào 5 ống mỗi ống 2 ml lòng trắng trứng 1: Đun sôi 2: thêm 1 giọt acid acetic 1% 3: thêm 0. 5 ml acid acetic 10% 4: thêm 0. 5 ml acid acetic 10% + 3 4 giọt Na. Cl bão hòa 5: thêm 0, 5 ml Na. OH 10% Đun sôi cả 4 ống, quan sát, nhận xét và giải thích kết quả

II. THỰC NGHIỆM VỀ ENZYME Thủy phân tinh bột bởi amylase Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme Ảnh hưởng của p. H đến hoạt tính của enzyme Tính đặc hiệu của enzyme

Thủy phân tinh bột bởi amylase • Nguyên lý: – Tinh bột là polysaccharide gồm nhiều đơn vị α D glucose nối với nhau nhờ liên kết α 1, 4 và liên kết α 1, 6 glycoside. Tinh bột không có nhóm aldehyde tự do trong phân tử, nên không cho phản ứng tromer âm tính. – Khi tinh bột bị amylase của nước bọt thủy phân, giải phóng đường đơn glucose tự do cho phản ứng tromer dương tính.

Các bước tiến hành • Điều chế dung dịch amylase – Sóc miÖng b» ng n íc cÊt – NgËm mét Ýt n íc cÊt khoảng 1 3 phót, khÏ cö ®éng l ìi ®Ó trén ®Òu n íc bät víi n íc cÊt, råi cho qua phÔu đã có bông hoặc giấy lọc, läc vµo èng được dd amylase Amylase

TN: 3 ml tinh bột 1%, 2 ml amylase ĐC: 3 ml tinh bột 1%, 2 ml nước cất TN ĐC Nhỏ lên phiến sứ 2 dãy lugol 1% Chú ý: + Không nhỏ quá đầy + 1 dãy TN, 1 dãy ĐC

Nhá vài giọt từ ống TN vào 1 lỗ ở dãy TN Nhỏ vài giọt từ ống ĐC vào 1 lỗ ở dãy ĐC. Sau khoảng 2 phút lại nhỏ vào lỗ tiếp theo. Quan s¸t sù ®æi mµu vµ nhËn xÐt.

PhÇn cßn l¹i cña 2 èng thö b» ng phản ứng Tromer TN ĐC - Cho vào cả 2 ống mỗi ống: 1 ml Na. OH 10%, 5 10 giät Cu. SO 4 5% Đun sôi, quan sát màu của ống nghiệm Chú ý: Nếu dd có D-glucose thì dd trong ống nghiệm sẽ chuyển màu đỏ gạch

Ảnh h ëng cña nhiÖt ®éđến hoạt tính của enzyme • Nguyªn lý: – PhÇn lín c¸c enzyme cã ho¹t lùc m¹nh ë th©n nhiÖt. NÕu nhiÖt ®é qu¸ thÊp thì enzyme sÏ ho¹t ®éng rÊt yÕu, ngù¬c l¹i nÕu nhiÖt ®é cao thì enzyme sÏ bÞ tª liÖt vµ bÞ huû ho¹i.

Các bước tiến hành 1 2 1 ml dd amylase - 1 ml dd amylase Ngâm vào chậu Đun sôi, để nguội nước đá 15’ 3 - 1 ml dd amylase Để ở nhiệt độ phòng - Cho vào cả 3 ống mỗi ống 1 ml tinh bột 1% - Để yên trong 5 -10 phút, thử bằng dd lugol 1% hoặc bằng phản ứng Tromer. Nhận xét và giải thích kết quả

T¸c dông ®Æc hiÖu của enzyme Oligo-1, 6 -glucosidase • Nguyên lý: (cắt -1, 6 glucoside) -amylase (cắt - 1, 4 glucoside) Sucrase Sucrose Fructose, Glucose

Các bước tiến hành 1 2 3 4 - 1 ml dd amylase - 1 ml dd sucrase 1 ml dd amylase 1 ml dd tinh bột 1% 1 ml sucrose 1% - Lắc đều thử bằng phản ứng Tromer. Nhận xét và giải thích kết quả - Chú y: sucrase (men bia)

Ảnh h ëng cña p. Hđến hoạt tính của enzyme • Nguyªn lý: – Vì có bản chất là protein nên enzyme rất mẫn cảm với p. H môi trường. – p. H môi trường cµng gÇn p. H tèi u, tèc ®é phản ứng cµng cao, nghÜa lµ enzyme hoạt động cµng m¹nh. – Sù thay ®æi p. H dï nhá còng ả/h ®Õn ho¹t ®é cña enzyme, do ả/h ®Õn tr¹ng th¸i ion hãa cña enzyme.

Các bước tiến hành p. H 1 5, 4 1 ml 5, 8 2 3 4 5 6 7 8 1 ml 6, 2 1 ml 6, 6 1 ml 6, 8 1 ml 7, 2 1 ml 7, 6 1 ml 8 1 ml Tinh bột 1% 1 ml Amylase 0, 5 ml 1 ml 1 ml 1 ml 0, 5 ml 0, 5 ml LÊy thËt chÝnh x¸c vµo c¸c èng nghiÖm ®¸nh sè tõ 1 8 theo bảng L¾c ®Òu, ®Ó 10’ råi thö b» ng dd lugol 1%, cho biÕt kÕt quả vµ nhËn xÐt.