Terapi untuk mengobati penyakit tententu menginsersikan gen yang

� Terapi untuk mengobati penyakit tententu �menginsersikan gen yang telah diperbaiki atau gen tertentu kedalam genom sel-sel atau jaringan individu menggantikan gen yang abnormal penyebab penyakit tersebut

� Insersi gen yang normal pada lokasi yang tidak spesifik di dalam genom � untuk menggantikan gen yang tidak berfungsi. � Prinsip umum yang paling sering digunakan � Gen abnormal dihilangkan dari genom individu dan digantikan oleh gen yang normal � Homologous � Gen recombination abnormal diperbaiki melalui cara selective reverse mutation � Mengubah regulasi (pengaturan) gen tertentu.

� � Terapi gen sel somatik (somatic cell gene therapy) Terapi gen sel germinal (Germ line cell gene therapy)

� Terapi gen sel somatik (somatic cell gene therapy) gene therapy non hereditable gen yang normal atau telah dimodifikasi ditransfer ke dalam sel-sel somatik pasien � mengobati/mengatasi gejala penyakit pasien � tidak dapat diturunkan kepada generasi selanjutnya gen yang telah diperbaiki ini hanya ada pada sel-sel somatik saja dan tidak ada pada sel-sel germinal. � mirip dengan transplantasi sel, jaringan atau organ � � Lebih rumit dan lebih berbahaya

Terapi gen sel somatik (somatic cell gene therapy)

� Terapi gen sel germinal (Germ line cell gene therapy)1, 2, 4 � Gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal � � diperbaiki dengan cara menginsersikan dan mengintegrasikan gen yang normal atau gen yang telah dimodifikasi kedalam genom sel -sel germinal Gen yang telah diinsersikan ini kemudian akan diturunkan ke generasi berikutnya Sangat bermanfaat untuk mengatasi penyakit-penyakit genetik dan penyakit-penyakit yang bersifat herediter masih sulit dilakukan karena alasan tehnis dan etik telah mengubah genetik seseorang

� Transfer gen yang telah dimodifikasi atau gen normal kedalam sel-sel sasaran pada pasien � Menggunakan vektor biologi yaitu virus � Menggunakan cara non virus naked DNA oligonucleotides lipoplexes dan polyplexes hibrid methods dendrimers

� Vektor biologi yang digunakan adalah virus susunan genetiknya telah diubah sehingga dapat membawa gen manusia yang normal � gen yang telah diperbaiki dimasukkan kedalam sel-sel sasaran pada tubuh manusia dengan cara tertentu dan kemudian berintegrasi pada genom tertentu � gen-gen pada virus yang dapat menyebabkan penyakit harus dihilangkan diganti dengan gen-gen yang telah diperbaiki � contoh virus A diketahui dapat berreplikasi atau memperbanyak diri dengan cara menginsersikan gen-gen nya kedalam genom sel-sel host. � virus ini mempunyai 2 jenis gene yaitu gen A dan gene B � Gen A mengkode protein untuk menginsersikan gen-gen nya kedalam genom sel host (inang) � Gen B menyebabkan timbulnya penyakit pada host gen C adalah gen yang telah diperbaiki � menggantikan gen B gen A tetap dipertahankan untuk menjalankan fungsinya.

� Vektor biologi yang digunakan adalah virus �Adenovirus merupakan virus generasi pertama yang digunakan dalam terapi gen dan sangat efektif sebagai vektor pembawa transgen 2, 4 �Virus lain retrovirus adeno-associated viruses virus herpes simplex virus penyebab HIV

� Retrovirus � � Materi genetik pada virus ini adalah dalam bentuk RNA Ketika retrovirus menginfeksi sel sasaran (host) RNA retrovirus, enzim reverse transcriptase dan integrase masuk kedalam sel sasaran RNA retrovirus akan diubah menjadi DNA melalui proses reverse transcription menggunakan ensim reverse transcriptase DNA kemudian akan ditransfer kedalam inti sel sasaran berintegrasi pada tempat tertentu di genom sel sasaran dengan bantuan ensim integrase � DNA yang telah diperbaiki ini juga akan terintegrasi pada tempat tertentu di genom sel sasaran �

� Retrovirus � Salah satu masalah yang dapat terjadi pada terapi gen enzim integrase dapat menginsersikan materi genetik virus pada tempat yang kurang sesuai � � � Hal ini sekarang dapat diatasi dengan menggunakan ensim Zinc finger nucleases 5 Keuntungan menggunakan retrovirus � pada bagian tengah gen-gen endogen pada host gen endogen ini tidak dapat berfungsi dikenal sebagai insertional mutagenesis pada gen pengatur fungsi gen lainnya proses pembelahan sel dapat tidak terkendali dan berubah menjadi sel kanker transgen yang dimasukkan bisa di transmisikan kesemua sel yang terinfeksi dan turunannya Kerugian dapat menyebabkan terjadinya mutasi genetik yang berbahaya selama tahap pengintegrasian

� Adenovirus � Ketika virus adenovirus menginfeksi sebuah sel inang molekul DNA virus tersebut akan dimasukkan kedalam sel inang tersebut materi genetik adenovirus tidak bersatu dengan materi genetik sel inang molekul DNA virus terletak bebas dalam inti sel dan proses transkripsinya berlangsung secara sendiri molekul DNA virus tidak ikut berreplikasi ketika sel mengalami pembelahan sehingga sel-sel inang hasil pembelahan tidak mengandung DNA virus � � � membutuhkan pemasukkan kembali gen-gen yang sudah dimodifikasi ke dalam populasi sel yang baru Sebaliknya keadaan ini akan mencegah terjadinya kanker Gendicine adenovirus yang telah mengandung gen p 53 yang digunakan pada terapi gen untuk mengobati penyakit kanker pada kepala dan leher sudah diizinkan oleh FDA China untuk digunakan pada manusia pada tahun 2003 FDA Amerika Serikat telah menyetujui advexin, suatu vektor yang serupa dengan Gendicine untuk digunakan di Amerika serikat pada tahun 2008

Transfer Gen menggunakan vektor Adenovirus (diunduh dari www. acceleratingfuture. com/michael/blog/? p=455)

� Keuntungan dapat diproduksi dalam jumlah besar � immunogenisitas pada sel inang yang rendah � � Beberapa metoda non virus yang dapat digunakan adalah � Naked DNA metoda transfeksi non virus yang sangat sederhana penelitian klinik dengan cara menyuntikan naked DNA secara intramuskular menunjukkan sebagian hasil yang sukses dan sebagian lagi mengalami kegagalan � ekspresi gen pada metoda transfeksi ini sangat rendah dibandingkan dengan cara transfeksi lainnya �

� Beberapa metoda non virus yang dapat digunakan adalah � Oligonukleotida Metoda menginaktifkan gen-gen yang terlibat dalam proses penyakit. Menggunakan antisense yang spesifik untuk gen sasasaran mengganggu proses transkripsi gen sasaran yang rusak. � Menggunakan oligonukleotida rantai ganda (double strand oligonucleotide) mengikat faktor-faktor transkripsi yang diperlukan untuk regulasi promoter gen sasaran �

� Beberapa metoda non virus yang dapat digunakan adalah � Lipoplexes and polyplexes Meningkatkan efisiensi transfer dengan cara melindungi DNA dari kerusakan dan memfasilitasi pemasukkannya kedalam sel Menggunakan molekul lipid � lipoplexes dan polyplexes dirancang untuk melindungi DNA dari proses degradasi selama proses transfeksi membungkus plasmid yang mengandung DNA dalam bentuk seperti micelle atau liposome lipoplexes atau polyplexes yang telah mengandung DNA dikenal sebagai lipoplex akan berinteraksi dengan membran sel dan masuk kedalam secara endositosis endosome yang mengandung lipoplex ini kemudian akan lisis dan transgen yang ada di dalamnya akan dikeluarkan ke dalam sitoplasma sel untu kemudian akan masuk ke dalam inti sel

� Beberapa metoda non virus yang dapat digunakan adalah � Metoda Hibrid (Hybrid method) Untuk meningkatkan efisiensi trnasfer transgen dikembangkan metoda hibrid (campuran) yaitu kombinasi liposome dengan virus influenza atau HIV yang diinaktifkan

� Beberapa faktor yang menghambat efektivitas penggunaan terapi gen � Masa hidup alami terapi gen yang pendek (Short-lived nature of gene therapy) � Respons Imunologik � gen yang dimasukkan kedalam sel-sel target harus dapat berfungsi sel-sel yang mengandung gen terapi ini harus dapat hidup lama dan stabil. adanya stimulus tertentu yang merangsang timbulnya respons imunologik dapat menurunkan efektivitas terapi gen adanya respon imunologik ini juga akan menyulitkan pengulangan terapi gen pada pasien Masalah dengan virus yang berfungsi sebagai vektor toksisitas, reaksi imunologik dan inflamasi, kontrol gen dan jaringan sasaran. kemungkinan pulihnya kembali kemampuan virus untuk menyebabkan penyakit pada manusia

� Beberapa faktor yang menghambat efektivitas penggunaan terapi gen � Kelainan gen multipel terapi gen sulit digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit yang disebabkan oleh adanya kombinasi gen-gen yang mengalami kerusakan � � penyakit jantung, tekanan darah tinggi, Alzheimer, artritis dan diabetes. Potensi untuk timbulnya tumor Bila DNA diintegrasikan pada tempat yang salah di dalam genom, misalnya pada daerah tumor suppressor gene, hal ini dapat menyebabkan timbulnya tumor. � pasien dengan X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) yang diterapi dengan sel punca darah (Hematopoietic stem cells yang diinfeksi oleh retrovirus yang mengandung transgen Tiga dari 20 pasien yang diterapi menderita leukemia 6

� Terapi gen pada manusia pertama kali dilakukan tahun 1990 � penyakit ”Adenosine deaminase-deficient severe combined immunodeficiency disease (ADA-SCID) � SCID (X-linked Severe Combined Immunodeficiency) � penyakit autosomal yang jarang terjadi � penderita tidak mempunyai sistem imun � beberapa penderita mengalami defisiensim adenosine deaminase (ADA) kadar deoxyadenosine yang terfosforilasi meningkat mencapai tingkat toksik dan terakumulasi dalam limfosit T � membunuh sel limfosit.

� � Sering terjadi pada anak laki-laki umur 1 tahun atau lebih >50% gen defek X-kromosom Defek pd rantai γ, reseptor IL 2, 4, 11, 15 Gen autosomal resesif: , def. Limfosit, def. enzim ADA, PNP

� Mulai terlihat pada umur 1 th � Infeksi penyakit sulit diobati: �Pneumonia �Meningitis �Sepsis (lemah/kritis) �Dermatitis/infeksi mulut �Diare �Hepatitis

� Contoh penggunaan adenovirus dalam terapi gen �terapi gen yang dipakai untuk mengobati cystic fibrosis (CF) virus adenovirus yang membawa gen CF diinhalasi oleh pasien � sel-sel paru akan terinfeksi dan mensintesa produk gen CF untuk mengatasi simptom dan gejala penyakit � kuatnya reaksi imunologik tubuh menyebabkan terapi gen menjadi tidak efektif Sel-sel yang terinfeksi virus dan mengandung transgen akan mati dan tidak bisa memperbanyak diri

� Persyaratan National Institute of Health (NIH) � Gen harus di klon dan diketahui karakteristiknya harus tersedia dalam bentuk murni � Metoda efektif � Resiko terapi gen harus dievaluasi secara berhati-hati seminimal mungkin � Penyakit tidak dapat diobati dengan cara lainnya � Harus ada data penelitian pendahuluan