Teorijski i eksperimentalni modeli starenja Goran imi Poslijediplomski

Teorijski i eksperimentalni modeli starenja Goran Šimić Poslijediplomski kolegij “Neurobiologija starenja” 28. ožujak 2011. Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Starenje è 1. Evolucijske teorije è 2. Teorije sistemskog starenja è 3. Eksperimentalni pristupi è 4. Mehanizmi u stanica koje se dijele è 5. Mehanizmi u stanica koje se ne dijele è 6. Histološke promjene mozga è 7. Smjernice za daljnja istraživanja

1. Evolucijske teorije starenja è 1. Programirana smrt organizama uslijed ograničenog broja diobi somatskih stanica (Weismann, 1889) è 2. Akumuliranje mutacija (Medawar, 1952) è 3. Antagonistička pleiotropija (Williams, 1957) è 4. Neinvestiranje u somatske stanice (Kirkwood i Holliday, 1979)

1. 1. Programirana smrt organizama è Nastaje uslijed ograničenog broja diobi somatskih stanica (tzv. Weismann-Swim-Hayflickov limit), a da bi se oslobodio prostor i resursi za mlađe generacije Odbačena zbog 3 glavna razloga: è 1. Postojanja velikih razlika u duljini života u prirodnoj i zaštićenoj okolini (npr. medijan duljine života čimpanzi u zatočeništvu je 23 g. za mužjake i 30 g. za ženke, a u prirodi oko 8 godina) è 2. Glatkoće Gompertz-Makehamove krivulje è 3. Kad bi mehanizam samouništenja bio oštećen kakvom mutacijom ove bi jedinke brzo nadvladale preostale (dajući više potomstva ili pružajući dulju roditeljsku skrb)

1. 2. Akumuliranje mutacija è Ne postoji selekcijski tlak za dugovječnost jer smo programirani samo da doživimo toliko dugo da bi smo se reproducirali: štetne mutacije što se izražavaju u mlađoj dobi podložne su jakom probiru (npr. Hutchinson-Guilford), a one koje poprimaju patološke razmjere tek u postreprod. dobi imaju malu mogućnost odstranjivanja (npr. AD), pa se takvi geni kumuliraju i prenose, a učestalost genetskih bolesti raste s porastom godina života dovodeći do sve većeg stupnja mortaliteta è Pomoću genealoških tablica potvrđena je pretpostavka teorije da je ovisnost duljine života potomaka povećana u onih potomaka čiji roditelji dulje žive (imprinting? ) è Pretpostavlja da u starenju učestvuje većina gena (70%)

1. 3. Antagonistička pleiotropija è Zbog sukoba interesa pleiotropnih gena (koji imaju učinak na više svojstava organizma) probir daje prednost mutaciji koja daje prednost u razdoblju reprodukcije (npr. gen što ugrađuje kalcij u kost: bez frakture u mladosti / prekomjerna kalcifikacija u starosti) è Objašnjava i ‘samoubilačke’ životne cikluse (npr. bambusa i pacifičkog lososa) è Predviđa da će uspješan odabir za produljeni život dovesti do smanjene reprodukt. sposobnosti u mlađoj dobi

Eksperiment odabira za produljeni život è 1976. Michael Rose (Univ. of Sussex): u nekoliko boca mlijeka smjestio 200 vinskih mušica i nakon 5 tjedana, kad su mušice došle pred kraj reproduktivnog razdoblja, pokupio jajašca, uzgojio ih i ponovio isti postupak nadajući se da će živjeti nešto duže nego prethodna generacija M. R. Rose. 2003. Can Human Aging Be Postponed? E-Book, Scientific American.

Rezultat: maksimalni životni vijek mušica se povećava è Od početnih 200 sada ima više od milijun mušica, a eksperiment svakodnevno nastavlja veći broj asistenata na Univ. of Irvine, CA: današnji potomci prvotnih mušica žive prosječno dvostruko dulje (oko 120 dana), što bi kod čovjeka odgovaralo dobi od oko 150 godina, te i dalje žive sve dulje i dulje è Nađeni porast dugovječnosti razmjeran je smanjenoj fertilnosti u ranoj odrasloj dobi i produljenom razdoblju razvitka do odrasle jedinke

Zaključci eksperimenta è Geni igraju važnu ulogu u starenju (mušicama nije poboljšana kvaliteta života i time očekivano trajanje života, već maksimalni životni vijek) è Postoji veći broj gena uključenih u starenje, jer da ih je malo, oni bi bili probrani već nakon samo nekoliko generacija è Nedostatci ekperimenta: 1. Smjer probira je umjetno nametnut, 2. Ne može odijeliti učinak odabira kasne reprodukcije na dugovječnost od direktnog odabira za dugovječnost

Dokaz o utjecaju gena na starenje čovjeka èU istraživanju 2872 danskih blizanaca rođenih 1870 -1880. g. (J Gerontol 1994) nađeno je da je razlika u dobi kad su umrli jednojajčani blizanci bila značajno manja od razlike u dobi kad su umrli dvojajčani blizanci èUtjecaj naslijeđa na varijabilnost u doživljenoj dobi relativno malen: 26% za muškarce, te 23% za žene 2721 par A Twin Study of the Genetic Contribution to Age-Related Functional blizanaca (USA): Impairment. Gurland et al. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2004; 59: 859 -863. 22% : 78%Ž

Nedostatci teorije antagonističke pleiotropije è Predviđa da bi brži razvitak do reprod. zrelosti trebao korelirati s bržim starenjem, rezultati to ne potvrđuju è Predviđa da je većina dugovječnih ljudi imala oštećenu reproduktivnu sposobnost, rezultati to ne potvrđuju è Dugoživuće mutante npr. C. elegans pokazuju prednost u teškim prirodnim uvjetima nad divljim sojem, suprotno očekivanju prema ovoj teoriji

1. 4. Neinvestiranje u somatske stanice è Na tragu ideje da su organizmi samo mediji (“survival machines”) ‘Sebičnog gena’ (Dawkins, 1976): Prirodni odabir favorizira manje investiranje organizama u popravak i održavanje somatskih stanica nego što je to neophodno za neograničeno preživljenje spolnih stanica (čiji je stupanj preciznosti održavanja visok, jer bi inače bile eliminirane) è Kroz odabir se mijenja investiranje u održavanje temeljnih staničnih sustava u odnosu na stupanj izvanjske opasnosti: ako je mortalitet uslijed okolišnih činitelja veći, to manje treba investirati u somatske stanice (a više u reprodukciju), npr. tvrdi oklop u dugovječnih kornjača ili nalaz da oposumi žive dulje ako im je stanište na otocima bez prirodnih neprijatelja

Kritika evolucijskih teorija starenja è Tvrde da je starenje nespecifičan proces, te da je u njega uključen ogroman broj gena; no, otkrića mutanti pojedinačnih gena što dovode do značajnog produljenja maksimalnog životnog vijeka ukazuju da mehanizmi starenja mogu uključivati samo manji broj gena i biti vrlo specifični AGE-1 (1988, C. elegans) CLK-1 (1996, C. elegans) DAF-1 (1997, C. elegans) MTH (1998, D. melanogaster) P 66 SHC (1999, Mammalia) MORF 4 (1998/99), MRG 15 (2001) (Mammalia) è kombinacijama se može postići aditivni učinak è è è

2. Teorije sistemskog starenja è Do sada predloženo >300 teorija è Imunološke (Walford, 1962: smanjena sposobnost razlikovanja tuđih od vlastitih antigena; Burnet, 1970: iscrpljenje klonova i smanjenje imunološke obrane) è Greške u sintezi (protein error theory, Orgel, 1963) i održavanju strukture proteina (chaperon theory, Miyaishi, 1995) è Teorija stresa: trošenje “adaptivne energije” (Selye, 1970); tijesno povezana s drugim endokrinološkim teorijama sistemskog starenja

Endokrinološke teorije starenja è Temelje se na uočenim smanjenim konc. cirkulirajućih humoralnih činitelja, poglavito hormona: estrogena (u menopauzi) i testosterona (u andropauzi), DHEA (dihidroepiandrosteron) i DHEAS (sulfat) (u adrenopauzi), te hormona rasta i IGF-1 (u somatopauzi) è Supstitucijska terapija npr. estrogenom u žena smanjuje mortalitet i za 10 godina (+poboljšava kogn. sposobnosti), ali ne povećava maks. životni vijek (što također nije dokazano ni za jedan drugi hormon)

DHEA (dehidroepiandrosteron) i hormon rasta DHEA je univezalni prekursor za nastanak androgenih i estrogenih steroida u perifernim tkivima; ima najveću konc. u dobi od 20 -25 g. , a zatim se postupno smanjuje do na oko 10 -20% vrijednosti u dobi od 80 godina Baltimore Longitudinal Study of Aging Traje od 1958. g. , prati 1500 ljudi; 2002 pokazala da je povećan životni vijek povezan s: 1. Manjom tjelesnom temp. 2. Manjom prosj. konc. inzulina 3. Većom konc. DHEAS

3. Eksperimentalni pristupi è 1. Progerije è 2. Kalorijska restrikcija è 3. Eksperimentalni modeli

3. 1. Progerije è 1. Wernerov sindrom è 2. Hutchinson-Guilfordov sindrom è 3. Down sindrom è 4. Cockayne sindrom è 5. Ataxia teleangiectasia

3. 1. 1. Wernerov sindrom è 1903/4. kao student medicine sy prvi opisao Otto Werner, a zatim Oppenheimer i Kugel 1935. èOčekivana dob života 44 -48 g. 14. g. 48. g. Lamin A/C Chen L et al. LMNA mutations in atypical Werner’s syndrome. Lancet 2003; 362: 440 -5. èSimptomi: arterioskleroza, ulceracije, maligniteti, dijabetes, osteoporoza, katarakta, itd. (“mozaičko starenje”) è 1996. Shellenberg GD i Martin GM otkrili WRN gen na 8. kromosomu što Oshima J et al. Homozygous and compound heterozygous mutations kodira jednu DNA helikazu (vrši despiralizaciju prije popravka DNA) at the Werner syndrome locus. Hum Mol Genet. 1996; 5: 1909 -13.

3. 1. 2. Hutchinson- Guilford è 1886. Jonathan Hutchinson, 1904. Hastings Guilford è Očekivana dob života 15 -20 g. è Simptomi i znakovi: brzo boranje kože, generalizirana alopecia, mali rast, distrofični nokti, usporeno spolno sazrijevanje, povećana ekskrecija hijaluronske kiseline? , smanjena mitotička aktivnost većine tkiva (“mozaičko starenje”) è Od 6300 pretraženih gena dosad nađeno 76 mutiranih (15 od njih su uključeni u kontrolu staničnog ciklusa pri mitozi, dezmoplakin I što se veže za kolagene, gen za galaktozil-transferazu, itd. )

3. 1. 3. Down sindrom èUslijed jedne prekobrojne kopije gena za APP na 21. krom. razvijaju patološke promjene karakteristične za AD (SP i NFT)

3. 1. 4. Cockayne sindrom èMultisistemski AR poremećaj popravka DNA, mikrocefalija, mentalna retardacija, atrofija retine, demijelinizacija, intrakran. kalcifikacije, u neuropatološkom nalazu još i NFT i bizarni astrociti èCSA protein (krom. 5), CSB protein, učestvuju u transkripciji i popravku DNA; tip I kasni, tip II rani èOstali simptomi: fotosenzitivni dermatitis, osjetljivost na ionizirajuće zračenje, itd.

3. 1. 5. Ataxia teleangiectasia è Nasljedni nedostatak popravka puknuća oba lanca DNA (karcinogeneza, naročito leukemije u djece i rak dojke, 100 x veća učestalost) uslijed mutacije ATM gena è ATM gen na 11. kromosomu kloniran 1995. g. kodira jednu fosfatidil-inozitol 3 kinazu što ima važnu ulogu u zaustavljanju staničnog ciklusa, aktivaciji gena za popravak DNA i regulaciji duljine telomera è Neurološki simptomi: ataksija i koreoatetoza (“little clowns”), progresivna neurološka deterioracija

3. 2. Kalorijska restrikcija è Glodavci s kalorijski ograničenom dijetom žive dvostruko dulje, za trećinu su manji, imaju manju tjelesnu temperaturu i manje obolijevaju è Iako još nisu poznati precizni mehanizmi, mnogobrojna istraživanja potvrđuju da uslijed smanjene razine oksidativne fosforilacije dolazi do posljedično smanjene produkcije ROS è Ograničenje kalorijskog unosa još uvijek je jedina eksperimentalna intervencija koja nepobitno dovodi do usporenja starenja i produljenja životnog vijeka u svih proučavanih vrsta

3. 3. Eksperimentalni modeli è 1. Kvasac (Saccharomyces cerevisiae) Ima 6000 gena è 2. Crv oblić (Caenorhabditis elegans) >40% homologija s genomom čovjeka è 3. Vinska mušica (Drosophila melanogaster) 4 para krom. , najveća DNA molekula uopće (41 x 109 k. Da) è 4. Miš (Mus musculus) Stupanj divergencije od čovjeka >100 mil. godina

Gompertz-Makehamove krivulje

Uspjeli ‘prirodni eksperiment’: Golokrtičasti štakor èPrimjerak opisan 2002. g. imao je 27. god. i 4 mj. , a većina članova kolonije starija je od 20 g. èPretpostavlja se da je uzrok dugovječnosti ovih štakora kombinacija sporog metabolizma, te života u dobro zaštićenim nastambama pod zemljom Buffenstein R, Jarvis JU. The naked mole rat--a new record for the oldest living rodent. Sci Aging Knowledge Environ 2002; 29: 7 Sherman PW, Jarvis JUM. Extraordinary life spans of naked mole-rats (Heterocephalus glaber). J Zool Lond 2002; 258: 307 -311.

4. Mehanizmi starenja u mitotički aktivnih stanica (>600 tipova) Leonard Guarente & David Sinclair labs èOdličan model jer su: individualne stanice smrtne (a ne besmrtne kako se to prije mislilo), Gompertz-Makehamova krivulja sliči višim vrstama, stanice prolaze karakteristične biokemijske (utišavanje oba lokusa za parenje) i morfološke promjene (akumulacija ožiljaka od stanica kćeri prilikom asimetrične diobe, povećanje veličine uslijed usporavanja staničnog ciklusa) po kojima se točno može znati koliko je stanica stara, razvijena prakt. metoda razdvajanja starih stanica

4. 1. Genetska nestabilnost èUzrok starenja je ‘ispadanje’ 150 -200 kratkih ponavljajućih slijedova DNA na krom. 12 èTo se dogodi negdje oko sredine životnog vijeka, a ta ERC (izvankromosomska kružna DNA) se dalje sama umnaža: kad dosegne između 500 i 1000 kopija, jezgrica se fragmentira a kvasac umre èNedostatak modela: u matičnih stanica sisavaca nema nikakve ERC

4. 2. Genetski programirano skraćivanje telomera FISH, Donax trunculus, Metafaza, CCAGGG èTelomere u eukariota služe zaštiti otvorenih krajeva DNA (od razgradnje enzimima, sljepljivanja s drugim kromosomima, mogućeg pogrešnog prepoznavanja otvorenih krajeva DNA) èSlijed TTAAGG (kralježnjaci, školjkaši i bodljikaši), TTAGG (kukci) ili pak TTTAGGG (biljke) ponavlja se nekoliko stotina do nekoliko tisuća puta); prilikom diobe ne mogu se u potpunosti replicirati DNA polimerazama jer one dodaju nukleotide samo u jednom smjeru

Telomeraza è Duljinu telomera nadoknađuje ribonukleoprotein telomeraza (koja prepoznaje jednolančane krajeve) è Aktivnost telomeraze je slaba u većini somatskih stanica starih ljudi, a stalno je aktivna samo u spolnim (telomerni nizovi su stalne duljine svojstvene za vrstu), tumorskim (otvara Za razliku od životinja kod kojih se mogućnost da se inhibicijom telomere skraćuju pri svakoj diobi, u možda zaustavi rast tumora) i biljaka je duljina stalno ista uslijed nekim stanicama koje se stalno nepromijenjenog izražaja dijele (npr. krvotvorne) telomeraza (npr. stanice sekvoje se dijele više od 4000 godina)

Telomere možda ipak nisu molekularni sat jer: è 1. Nema jasne korelacije između starosti donora i replikativnog starenja njegovih stanica è 2. Većina progeroidnih stanica umre i prije nego li im se skrate telomere è 3. Miševi bez gena za telomerazu ne pokazuju odstupanja, osim za mitotički jako aktivna tkiva u poodmakloj dobi è(4. ) Pokušaj produljivanja tumorigeneza

5. Mehanizmi starenja u mitotički neaktivnih stanica Antioksidativni enzimi: è 1. Zn/Cu SOD è 2. Katalaza è 3. Glutation reduktaza itd. MPTP H 2 O 2 + MPP+ (model PD) (1 -metil-4 -fenil-1, 2, 3, 6 tetrahidropiridin) Transgenična drozofila za 1. i 2. živi 34% dulje, a uslijed umetanja SOD čovjeka 40% dulje

5. 1. Oksidativno oštećenje slobodnim radikalima kisika Melatonin (cave: miš s povećanom koncentracijom melatonina opak ima skraćen životni vijek uslijed nastanka tumora) Biljezi oksidacije kao nitrotirozin, 8 OHd. G (8 -hidroksi-2’-deoksigvanozin) i drugi pokazuju veći stupanj oksid. u moždanom tkivu starijih osoba

5. 2. Mutacije mt. DNA è 1. Uobičajeni stupanj mutacija 10 -20 x veći nego u jezgri è 2. Oštećenja dovode do smanjene produkcije ATP i omjera NAD/NADH, što povećava konc. ROS è 3. Transgenični C. elegans za CLK 1 gen (kodira koenzim Q) produljuje život za oko 30% è 4. Veći rizik za nastanak AD imaju osobe kojima je majka oboljela od AD, a ne otac

6. Neke najčešće univerzalne histološke promjene mozga u normalnom starenju Lipofuscin (oks. lipidi i proteini) Corpora amylacea Neuromelanin (nusprod. sinteze katehol. ) Umjerena astroglioza

Promjene mozga u starenju većine normalnih ljudi è Leukoaraioza (vaskularne promjene malih krvnih žila uslijed hijalinih arteriosklerotskih promjena s nastankom tortuoziteta) è Ireverzibilna glikozilacija mnogobrojnih proteina è Neuropatološki pojam ‘čistog starenja’ (sela na Sardiniji)

7. Neke smjernice za daljnja istraživanja è 1. Integracija genskih i fizičkih mapa genoma čovjeka (~2% DNA s oko 30000 gena 98. 77% jednakih čimpanzi) + dešifriranje negenomske DNA (~98%), mehanizmi genske regulacije è 2. Mikropostrojbena analiza DNA u starih osoba (već znamo da su sa starenjem povezani npr. geni za apo. E, ACE, HLA-DR i PAI-1) è 3. Otkriti zašto neki klonovi stare sporije (npr. većina klonova teladi)

Utišavanje gena kao jedna od novijih teorija starenja The aging process involves silencing of the genes through methylation of promoter sequences and the acetylation of histones (this process contributes not only to aging, but also cancer when silencing affects tumor suppressor genes). Evidence of activation of silenced genes can be pursued by documenting the relationship between 'molecular switches‘ (antineoplastons) - DNA-demethylating agents and histone deacetylation inhibitors, genes which are turned on by them, and clinical anti-aging changes. Sir 2, 3 i 4 geni (nalaze se na krajevima kromosoma u blizini telomera) uključeni su u kontrolu starenja stanica jer Sir proteini djeluju kao deacetilaze Burzynski SR. Gene silencing - a new theory of aging. Med Hypotheses. 2003; 60: 578 -83.

96 -godišnja manekenka poznate kozmetičke kuće (U. K. )