Tema 5 Protocolos para obtencin de datos calibrados

Tema 5 Protocolos para obtención de datos, calibrados, ajuste de curvas Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Etapas de una investigación Análisis : tests estadísticos, ajuste de curvas , …. Exploración de datos Obtención datos, calibrados, ajustes etc. Diseño del experimento Antecedentes Bibliográficos Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Hay diferentes protocolos según los estudios (1/2) 1) Estudios experimentales de laboratorio (ej. : Determinar la Km y Vmax de una enzima usando regresión no lineal): a) Concretar el procedimiento experimental. b) Preparación de disoluciones y comprobar su estabilidad en el almacenamiento. VITAL c) Rectas de calibrado: - Diferencia entre precisión y exactitud. Estimación de una media con intervalo de confianza (barras de error) - Ajuste de una recta a los datos por regresión lineal, bandas de confianza. - Predicción inversa. d) Hacer las medidas experimentales del estudio, recopilar los datos en una tabla de EXCEL y hacer una representación inicial de los datos. Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Hay diferentes protocolos según los estudios (2/2) 2) Estudio clínicos (observacionales o de intervención) (por ej. comparación de la eficacia de un nuevo fármaco frente a placebo (test t de student)): a) Elegir la población objeto del estudio. b) Establecer el tamaño de muestra, el tipo de aleatorización, tipo de “ciego”. c) Elaboración de encuestas o de procedimientos de medida. d) Hacer las observaciones o medidas. e) Recopilar los datos en una tabla de EXCEL. (En lo que sigue (en este tema 5) nos ocuparemos principalmente de lo estudios experimentales de laboratorio y en el tema 7 de los estudios clínicos) Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

a) Establecer primero el protocolo experimental Procedimiento Termostatar 1) 0. 1 m. L enzima 2) 0. 1 m. L sustrato 3) 9. 6 m. L disolvente 4) 0. 2 m. L agua 10 m. L total Toma de muestra 1) Tiempos ( 1 h, 2 h, 3 h, … 24 h) 2) 200 m. L muestra + 400 m. L tampón Medida de absorbancia Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Se suelen hacer réplicas de muestreo Enzima + Sustrato Réplicas de muestreo (3 o 5 réplicas a cada sustrato) ¡CV(%) grande! Se toman alícuotas Medida Absorbancia No suele ser necesario réplicas de técnica Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado ¡CV(%) pequeño!

¿Cuántas réplicas se deben hacer? 1) Cuando se desea estimar la media: CV(%) 1 2 3 4 5 nº réplicas (La media se estabiliza a partir de 3) 2) Cuando se desea estimar la desviación estándar: CV(%) 1 2 3 4 5 nº réplicas (La desviación estándar se estabiliza a partir de 5) Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Obtener datos sin artefactos • Buenas prácticas experimentales: ü Hacer bien referencias en la técnica analítica ü Analizar bien controles o blancos. üComprobar exactitud y línea base de aparatos • Buenas prácticas numéricas: ü Para cálculos elegir unidades para que los valores sean del orden de “ 1 ” (ej. 3. 2 m. M es mejor que 0. 0000032 M o 3. 2. 10 -6 M) üTrabajar con los valores de todas las réplicas (no sus medias), para que los tests estadísticos en el ajuste de curvas tengan los grados de libertad correctos. Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Recordatorio de cifras significativas Concepto de cifra significativa : Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Diferencia entre precisión y exactitud. Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Simil para diferencia entre precisión y exactitud. Imaginemos el tiro con carabina a una diana: Error absoluto y error relativo Error absoluto: Error relativo: Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Estimación de una media por intervalo de confianza Población: niños españoles al nacer Variable: Peso en kg Muestra grande 3. 5 3. 7 2. 8 3. 3 …. . Intervalo de confianza (Límites de confianza, barras de error) Población: células en un cultivo Muestra pequeña 6. 2 106 Variable: nº células/m. L 6. 8 106 5. 9 106 Réplicas Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Recordatorio de la distribución normal Basado en J. P. Domènech (Bioestadística) Normal: Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado Normal estandarizada:

Comportamiento de las medias de diferentes muestras sacadas de una población (Teorema del límite central) Adaptado de J. P. Domènech (Bioestadística) Se toman infinitas muestras al azar de tamaño “n” Población origen (x) Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado Población medias

Generalización para la estimación de una media por intervalo En general la estima de m de la población desde una muestra grande: Donde: La estima de m de población desde una muestra pequeña: desvío para riesgo a, normalmente: a=0. 05 ((1 -a)=0. 95 (95%) ) Donde: “t” Student con n grados de libertad y riesgo a n= n-1 a=0. 05 , ((1 -a)=0. 95 (95%) ) 2 colas Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Ejemplo: estimación de medias con intervalos al 95% Muestra 3 5% Muestra 83 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Ejemplo: simulación de medias con intervalos al 95% Simulamos al azar: 7 muestras con 10 datos y con: Muestra 5 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 4 Muestra 3 Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado Muestra 6 Muestra 7

Otros tipos de intervalos de confianza (datos simulados) 3 datos (IC 95%) 3 datos barras 1 s (IC 68 %) 7 datos (IC 7 datos 30 datos 95%) barras 1 s (IC 68 %) Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Puntualizaciones acerca de la varianza y desviación estándar En la población En un muestra (se hace la corrección de Bessel y en vez de n se pone n-1) Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

c) Rectas de calibrado y predicción inversa Ajuste de una recta por regresión lineal simple y bandas de confianza El llamado método de Allen se utiliza para medir concentraciones de fosfato en base a una reacción coloreada con molibdato. Para ello hay que hacer primero la recta de calibrado o ley de Beer a partir de unos patrones de fosfato. Predicción inversa Evaluación SIMFIT Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

c) Rectas de calibrado y predicción inversa. Evaluación y predicción inversa Evaluación: Se introduce la “x” y se desea la “y” (no suele tener interés) Predicción inversa: Se introduce la “y” y se desea la “x” (es lo que interesa, medir la absorbancia de una muestra y estimar la [fosfato]) 0. 231 0. 472 SIMFIT Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Cuando los calibrados tiene forma de curva Ejemplo: Ajuste de la curva por un polinomio de grado 2 y = a + bx + cx 2 Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado