Tecniche diagnostiche in parassitologia 1 Ogni parassita viene

Tecniche diagnostiche in parassitologia 1. Ogni parassita viene messo in evidenza attraverso uno specifico esame diagnostico in funzione di: • localizzazione nell’ospite umano; • vie di uscita delle forme di disseminazione del parassita dall’ospite umano; • caratteristiche morfologiche e biologiche del parassita; • necessità di diagnosi differenziale tra specie affini. 2. Il medico che prescrive l’esame si orienta in base a: • segni clinici (spesso molto aspecifici); • risultati di esami generici (es alta eosinofilia = parassitosi); • origine geografica o viaggi recenti; • abitudini alimentari, professionali, tempo libero; • eventuali terapie farmacologiche. 3. Un esame negativo non è sufficiente a definire l’assenza di una parassitosi: necessità di esaminare più prelievi per almeno 3 gg non consecutivi. 1

La febbre

Eosinofilia FILARIE

La barriera della mucosa intestinale 1 Lo strato di muco, i peptidi antimicrobici e le Ig. A tengono sotto controllo il numero di microrganismi e impediscono che i proliferino direttamente a contatto con gli enterociti.

La barriera della mucosa intestinale 2 Le cellule dell’epitelio intestinale hanno anche un ruolo fondamentale nel regolare le cellule coinvolte nella risposta adattativa.

La barriera della mucosa intestinale 3 Gli enterociti sono caratterizzati dalla presenza del TLR 4 Soprattutto le cellule dell’epitelio intestinale hanno un ruolo diretto nella risposta innata.

Il TLR 4 è un “interruttore” che a cascata attiva i geni caratteristici delle risposta Infiammatoria • • I TLR sono recettori di membrana attivati da molecole caratteristiche dei patogeni dette PAMP (Pathogen. Associated Molecular Patterns) Il TLR 4 ad esempio è attivato dai lipolisaccaridi (LPS) dei batteri Gram-negativi Il TLR 4 è il primo livello di attivazione della risposta innata L’esito finale della sua attivazione sarà l’espressione, tramite il fattore di trascrizione NF-k. B, dei geni coinvolti nella risposta infiammatoria

Blastocystis hominis Un protozoo che cerca di risultare invisibile al nostro sistema immunitario

Proposed life cycle for Blastocystis cells taking into account recent studies (163, 169, 201, 295) suggesting the existence of zoonotic genotypes (subtypes 1 to 7) with various host specificities. Si distinguono 7 sottotipi che si differenziano per specificità d’ospite e costituzione genetica Kevin S. W. Tan Clin. Microbiol. Rev. 2008; 21: 639 -665

Morphological forms of Blastocystis sp. subtype 4 by phase-contrast microscopy. Blastocystis è un protozoo estremamente polimorfico e con dimensioni estremamente variabili. Ha un rivestimento (surface coat) di probabile origine polisaccaridica cui componenti son scarsamente immunogenici. Kevin S. W. Tan Clin. Microbiol. Rev. 2008; 21: 639 -665

B. hominis è di gran lunga il protozoo prevalente nell’intestino umano • Blastocystis è un protozoo presente con alta frequenza sia in soggetti sani che in pazienti con sintomi intestinali • La frequenza di Blastocystis nella popolazione europea è stimata essere intorno al 30% considerando un campionamento casuale • La percentuale sale di molto se si considerano i soggetti con disturbi intestinali • In questo studio su un campione di pazienti presso un ospedale italiano si supera il 50% fra soggetti con sintomi intestinali • I casi di co-infezione con altri parassiti o batteri non sono rari Masucci L, Graffeo R, Bani S, Bugli F, Boccia S, Nicolotti N, Fiori B, Fadda G, Spanu T. Intestinal parasites isolated in a large teaching hospital, Italy, 1 May 2006 to 31 December 2008.

Risposta Immunitaria • Risposta innata (in vitro): A contatto con colture cellulari (HT-29) può indurre la produzione di citochine pro-infiammatorie (IL-8, GM-CSF), ma l’effetto è temporaneo (24 h) • Risposta Adattativa: 1. Induce prevalentemente Ig. M (tipica risposta ad antigeni ripetitivi come i carboidrati). Risposta T indipendente? Le glicoproteine di superficie (surface coat) potrebbero funzionare da “cortina fumogena”. 2. Livelli elevati di anticorpi specifici (Ig. A e Ig. G seriche) si osservano solo in soggetti con infezioni prolungate (2 anni) o con infezioni sintomatiche, appaiono inefficaci nel bloccare il parassita • Anticorpi specifici (in vitro) non inibiscono la crescita del parassita, anzi selezionano cloni che non vengono riconosciuti (variazione antigenica? )

Blastocystis è un parassita o un commensale? Una questione irrisolta • Che danno fa all’ospite? • Molti dei portatori sono completamente asintomatici, altri invece hanno sintomi generici • Esistono studi che dimostrano una maggiore prevalenza di B. hominis in pazienti con la sindrome dell’intestino irritabile (IBS), altri studi smentiscono questa ipotesi • B. hominis può scatenare una risposta di tipo infiammatorio? • Altri studi mettono in relazione la patogenicità con il particolare sottotipo di B. hominis • L’effetto patogenetico potrebbe essere indiretto, dovuto all’alterazione del microbioma intestinale

Model for pathogenesis of Blastocystis spp. Blastocystis esprime potenziali fattori di patogenicità Kevin S. W. Tan Clin. Microbiol. Rev. 2008; 21: 639 -665

Figure 2. Differential effects on tight junction protein degradation in Caco-2 cell monolayers by different strains of Blastocystis. • • • Almeno un sottotipo ha un effetto citopatico con degradazione delle tight junction (ST-7) Altri sottotipi sembrano non avere effetto alcun effetto citopatico (ST-4) All’interno di uno stesso sottotipo isolati diversi sembrano avere un effetto citopatico diverso ST-4 Nessun effetto ST-7 Evidente effetto citopatico Wu Z, Mirza H, Tan KSW (2014) Intra-Subtype Variation in Enteroadhesion Accounts for Differences in Epithelial Barrier Disruption and Is Associated with Metronidazole Resistance in Blastocystis Subtype-7. PLOS Neglected Tropical Diseases 8(5): e 2885. https: //doi. org/10. 1371/journal. pntd. 0002885 http: //journals. plos. org/plosntds/article? id=10. 1371/journal. pntd. 0002885

Giardia duodenalis Un Parassita Che Riesce Ad Eludere Sia La risposta Innata Che Quella Adattativa

I Trofozoiti sono a stretto contatto con gli enterociti e dovrebbero stimolare la loro risposta innata.

Possibili meccanismi patogenetici Alcuni aspetti della giardiasi possono essere l’effetto diretto della risposta immunitaria al parassita.

Fattori di virulenza Fra i fattori di virulenza del parassita si annoverano i meccanismi che gli consentono di contrastare la risposta immunitaria dell’ospite.

Giardia riesce a contrastare i meccanismi di risposta innata Degrada citochine infiamma torie Alcuni meccanismi che bloccano la risposta infiammatoria sono ignoti. Riduce la produzione di ossido nitrico Attenuando la risposta innata Giardia può favorire la presenza di altri patogeni

La Risposta Adattativa dell’ospite è diretta contro le proteine VSP che ricoprono il trofozoita Le VSP, proteine di superficie che ricoprono l’intero trofozoita, condizionano la risposta adattativa portando alla produzione di Ig. A secretorie dirette contro di esse. Parasite Immunology Volume 37, Issue 8, pages 394 -406, 28 JUL 2015 DOI: 10. 1111/pim. 12210 http: //onlinelibrary. wiley. com/doi/10. 1111/pim. 12210/full#pim 12210 -fig-0002

Antigenic variation in Giardia lamblia Potenzialmente Giardia potrebbe esprimere 200 diverse VSP= Variant Surface Protein Ciclicamente i trofozoiti interrompono l’espressione di una VSP per esprimerne una diversa. Nell’esempio: un anticorpo che prima riconosceva tutti i trofozoiti di una coltura dopo un certo numero di cicli di replicazione ne riconosce solo alcuni. La variazione antigenica rende inefficace la risposta umorale. Cellular Microbiology Volume 11, Issue 12, pages 1706 -1715, 25 AUG 2009 DOI: 10. 1111/j. 1462 -5822. 2009. 01367. x http: //onlinelibrary. wiley. com/doi/10. 1111/j. 1462 -5822. 2009. 01367. x/full#f 1

La variazione antigenica dei trofozoiti non avviene sulla base di modificazioni genetiche ma tramite un tipico meccanismo epigenetico che prevede l’espressione di multipli m. RNA per le VSP e il “silenziamento” alternato di alcuni di essi. Solo 1 degli m. RNA possibili verrà tradotto per produrre una VSP, gli altri verranno silenziati.

Tecniche diagnostiche in parassitologia 4. LA DIAGNOSI PARASSITOLOGICA NON E’ ESENTE DA RISCHI PER IL TECNICO BIOMEDICO. Manipolando campioni biologici è possibile contrarre per contatto, ingestione o inalazione non solo il parassita che si sta ricercando, ma anche batteri, virus e miceti. Protezione fisica personale: Mascherine, Guanti, Camici. Protezione fisica ambiente: Cappe, Lampade UV, calore. Protezione chimica: Alcool, Formalina, Ipoclorito di Sodio 2

Esame copro-parassitologico 3 La coprologia parassitaria permette di evidenziare ed identificare quasi tutti i parassiti che vivono nel tubo digerente e quelli per i quali le feci costituiscono il normale veicolo di disseminazione nell’ambiente esterno. Principali parassiti che è possibile rinvenire nelle feci umane: PROTOZOI: - Flagellati intestinali: • Trofozoiti e cisti di Giardia intestinalis - Amebe intestinali: • Trofozoiti e cisti di Entamoeba spp. • Trofozoiti e cisti di Entamoeba hystolitica - Ciliati intestinali: • Trofozoiti e cisti di Balantidium coli - Sporozoi intestinali: • Oocisti di Cryptosporidium • Oocisti di Sarcocystis • Oocisti di Isospora • Oocisti di Cyclospora METAZOI: - Trematodi digenei: • Uova di Digenei intestinali • Uova di Digenei epato-biliari • Uova di Schistosoma spp. - Cestodi: • Proglottidi e uova di Tenie • Proglottidi e uova di Hymenolepis spp. • Uova di Dyphyllobotrium spp. • Proglottidi e uova di Dipylidium - Nematodi: • Uova di geoelminti umani • Larve di Strongyloides stercoralis - Artropodi: • Larve di mosche agenti di miasi intestinali

Esame copro-parassitologico L’esame parassitologico di feci umane può dare esito negativo quando: • L’intestino non rappresenta la normale via di eliminazione delle forme di disseminazione del parassita (es Trichinella); • Il parassita non depone le uova nel lume intestinale, ma a livello delle pliche perianale (ossiuri); • La parassitosi è determinata da un solo individuo e/o da un solo sesso; • Il parassita non è specifico dell’uomo (immaturità sessuale, larva migrans); • Il prelievo è effettuato in una fase “muta” (es infestazione molto recente o dopo inadeguato trattamento farmacologico). Gli esami copro-parassitologici possono essere effettuati su: Feci NON fissate: • esame macroscopico • esame microscopico diretto • diafanizzazione secondo Kato • conteggio uova • concentrazione di cisti e uova • colture • colorazioni permanenti Feci FISSATE: • esame macroscopico • concentrazione per sedimentazione • colorazioni permanenti (se fissate in SAF, PVA o Schaudinn) 4

5 Esame copro-parassitologico 1. Prelievo e trasporto dei campioni fecali. • Recipienti trasparenti, puliti ed asciutti (non necessariamente sterili, a meno che il campione non serva anche per analisi batteriologiche e/o micologiche). 2. Quantità del campione fecale. • Da 1 a 5 gr o in toto, a seconda della disponibilità e del parassita da ricercare e della tecniche da utilizzare. 3. Qualità del campione fecale. • Appena emesso e mantenuto a 37°C (ideale). • Conservato a 4°C fino a 24 ore. • Fissato preventivamente con: MIF (Mercurotiolato) PVA (Alcool polivinilico) Formalina 10%: Attenzione!

Esame copro-parassitologico Permette di identificare ELMINTI ADULTI e LARVE DI INSETTI presenti nella massa fecale: • accidentalmente • per eliminazione spontanea o dopo terapia Macroscopico Permette di identificare CISTI e TROFOZOITI di PROTOZOI, UOVA e LARVE di ELMINTI. Microscopico Diretto Permette di esaminare piccole quantità di feci (1 -2 µg). Adatto per evidenziare protozoi, uova e larve di elminti, ma solo in presenza di un’elevata carica parassitaria. Dopo concentrazione Striscio fecale 6 Permette di esaminare campioni > 1 gr e di evidenziare elementi parassitari dispersi in grande massa di feci. Permette di ottenere preparati permanenti da utilizzare se non è possibile l’esame immediato del preparato o quale documentazione

Esame copro-parassitologico macroscopico Contenuto in acqua Flusso biliare, ossidazione, fermentazione Consistenza Colore 7 • Caprina • Composta • Poltacea • Cretacea (presenza lipidi) • Semiliquida (presenza muco) • Liquida • Scuro Sangue (*) o medicinali • Ipocolico • Verde biliverdina, vegetali o medicinali • Ocra stercobilinogeno • Chiaro leucostercobilina (*) Se c’è il sospetto di presenza di sangue nelle feci è necessario effettuare ricerca di sangue occulto tramite apposito kit (dopo aver effettuato per 3 gg una dieta specifica)

8 Esame copro-parassitologico macroscopico: elementi patologici non parassitari Apparenza: • Suddiviso, con bilirubina Muco • Disperso • Superficiale • Amorfo • Coagulato, in filamenti * Origine: Tenue Colon Basso crasso Intestino in generale Colon (colite mucomembranosa) * Possibilità di confusione con parassiti. • Segnalare eventuale presenza di sangue (indice di lesioni intestinali) • Misurare ed indicare p. H.

9 Esame copro-parassitologico macroscopico: tecniche di preparazione per diagnosi di METAZOI PRELIEVO, RISCIACQUO IN SOLUZIONE FISIOLOGICA ed EVENTUALE FISSAZIONE IN ALCOOL GLICERINATO AL 70% (attenzione: NO formalina > 5%) • Vermi di grosse dimensioni: prelievo direttamente tramite pinzette o filtrazione tramite un colino. • Vermi di piccole dimensioni (Ø< maglie colino): sedimentazione. Platelminti • Chiarificare con ACIDO ACETICO o con LATTOFENOLO • Colorare con CARMINIO Nematodi • Chiarificare con LATTOFENOLO Larve insetti • Chiarificare con LATTOFENOLO • Isolare spiracoli posteriori

Esame coprologico macroscopico: METAZOI 10 Elminti adulti (o segmenti di elminti adulti) possono essere ritrovati nelle feci, ed osservati spesso anche ad occhio nudo, nei seguenti casi: T. Digenei Cestodi Nematodi • • Appiattiti Fogliacei Lanceolati 1 mm - 6 cm • Appiattiti • Nastriformi • Segmentati • Cilindrici • Estremità affusolate • 1 mm - 30 cm Si ritrovano nelle feci solo per distacco del parassita dalla sua sede (es in seguito a terapia) Eliminazione delle PROGLOTTIDI attraverso le feci indispensabile per la continuazione del ciclo biologico di molte specie. • • Fuoriuscita spontanea obbligata Fuoriuscita spontanea accidentale Eliminazione spontanea Eliminazione dopo terapia

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Esame copro-parassitologico microscopico DIRETTO: • Permette di esaminare piccole quantità di feci (1 -2 µg). • Adatto per evidenziare: Cisti di protozoi Forme vegetative mobili di protozoi (es immediato su tavolo riscaldato) Uova e larve di elminti (in presenza di un’elevata carica parassitaria) • Stemperare 1 -2 µg feci su portaoggetti con goccia soluzione fisiologica • Aggiungere 1 goccia colorante non permanente: 1. Soluz iodurata di Lugol: evidenzia cromatina dei nuclei, flagelli, etc 2. Eosina al 2% evidenzia elementi parassitari NON colorati su sfondo rosso; 3. Carbolfuxina: evidenzia cisti do Sporozoi NON colorati su sfondo rosso; • Mescolare con un angolo del vetrino coprioggetto in modo da distribuire uniformemente il materiale fecale sul vetrino portaoggetto; • Coprire con vetrino coprioggetti ed conservare in camera umida. LA DENSITA’ FINALE DEL PREPARATO DEVE ESSERE TALE DA COSENTIRE ATTRAVERSO DI ESSO LA LETTURA DI UN TESTO. 12

TECNICHE di CONCENTRAZIONE 13 • Consentono l’esame di quantità di feci > 1 gr e l’eliminazione di detriti fecali, aumentando la possibilità di rinvenire parassiti anche se presenti in piccoli numeri. • Necessitano di campione sospeso in maniera omogenea (oppure occorre prendere diverse aliquote in varie punti) • Esistono metodiche elettive per ciascuna classe di parassita Metodi FISICI: si basano sulla diversa densità di detriti fecali ed elementi parassitari. • Sedimentazione (parassiti più pesanti del liquido di diluizione) • Flottazione (parassiti più leggeri del liquido di diluizione) • Sedimentazione + Flottazione Metodi DIFASICI (chimico-fisici): consentono di solubilizzare ed eliminare i lipidi e di rimuovere gran parte dei detriti e delle sostanze proteiche e mucose. • Etere-formolo • Metodo di Ritchie • Metodo di Ridley

Tecniche di concentrazione: METODI FISICI 14 Si basano sulla diversa densità di detriti fecali ed elementi parassitari • Sedimentazione: gli elementi parassitari sono più densi del liquido di diluizione e si depositano spontaneamente o in seguito a centrifugazione; • Flottazione: il liquido di diluizione è più denso degli elementi parassitari che quindi galleggiano; permetto di raccogliere un materiale più pulito, ma ma alcune uova e cisti possono collassare rendendo difficile l’identificaz. • Sedimentazione + Flottazione: utilizzo successivo di liquidi a diversa densità. Densità di alcuni parassiti: • Giardia • E. histolitica • E. nana • E. coli 1, 060 1, 065 -1, 070 >1, 070 • Ancylostoma • Ascaris (fertile) • Ascaris (sterile) • Trichuris 1, 065 1, 110 1, 200 1, 150

Tecniche di concentrazione Vantaggi: semplicità esecuzione Sedimentazione in H 2 O glicerinata allo 0, 5% Ricerca uova T. Digenei Non idonea per protozoi Sedimentazione di Baermann Ricerca larve Strongiloides Specifica Flottaz di Fuellerbon (soluz satura Na. Cl) Ricerca aspecifica di parassiti Distorsione di protozoi e larve; flottazione di lipidi. Flottaz di Willis (soluz satura Na. Cl) Ricerca aspecifica di parassiti Distorsione di protozoi e larve; flottazione di lipidi. Flottaz Janesko Urnanyi (soluz iodo-mercurata di K) Flottaz di Sheater (Saccarosio, fenolo) Ricerca uova T. Digenei Ricerca Cryptosporidium, Isospora, Sarcocistis Distorsione di protozoi e uova; flottazione di lipidi, Me pericoloso. Specifica; fenolo tossico. Centrifugaz-Flottaz di Faust in soluz. Acquosa di solfato Zn Ricerca aspecifica di parassiti Distorsione piccole cisti; No uova pesanti; molte manipolazioni. Centrifugaz-Flottaz di Di Felice - Ferretti, in soluz. acquosa di saccarosio e Na. NO 3 Ricerca aspecifica di parassiti (Cestodi e Nematodi) No uova T. Digenei; No larve Strongiloides; molte manipolazioni. 15

16 Sedimentazione in H 2 O glicerinata (Favot e Ingalls): 1) Diluire 5 gr feci in soluzione acquosa allo 0, 5% di glicerina 2) Filtrare attraverso una garza 3) Versare il filtrato in un matraccio conico 4) Sedimentare per 1 ora 5) Ripetere 2 e 3, lasciando sedimentare per 45’ 6) Ripetere 2 e 3, lasciando sedimentare per 30’ 7) Prelevare tre campioni da 0, 1 ml ciascuno, rispettivamente dalla superficie, dal centro e dal fondo del sedimento.

Tecniche di concentrazione: METODI DIFASICI Metodo di BAILANGER • Diluire 2 -3 gr feci in 10 vol tampone aceto-acetico, p. H 5 (16 gr acetato di Na cristallizzato + 3, 6 ml acido acetico + H 2 O fino a 1 l; filtrare su garza o filtro metallico sterili) • Sedimentare per 1‘ • Emulsionare con 1 vol di Etere • Centrifugare 1600 -2500 gpm per 1’-3’ • Esaminare sedimento goccia a goccia sotto al microscopio Fase organica sciolta dall’etere Lipidi e detriti Fase acquosa PARASSITI Questa tecnica richiede molte manipolazioni e uso di Etere volatile Esistono KIT chiusi (es PARA-PACK) che sfruttano gli stessi principi, ma riducono al minimo le mainipolazioni da parte dell’operatore. 17

Tecniche di concentrazione: METODI DIFASICI Metodo di RITCHIE • Diluire feci 1: 10 in Na. Cl (9/1000) • Filtrare • Centrifugare • Decantare • Risospendere in soluz. salina • Centrifugare, decantare e risospendere fino a chiarificazione completa del sovranatante • Sospendere sedimento in Formalina 10%. • Decantare • Emulsionare con 3 ml di Etere • Centrifugare 1500 gpm per 2’ • eliminare sovranatante • Esaminare sedimento goccia a goccia sotto al microscopio 18 Metodo di RIDLEY • Emulsionare 1 gr feci in 7 ml di Formaldeide al 4% (formalina 10%) • Filtrare con setaccio metallico • Aggiungere 3 ml Etere etilico • Agitare vigorosamente per >1’ • Centrifugare 500 gpm per 2’ • Eliminare strato superiore (etere) • Eliminare tappo lipidico con una bacchetta • Eliminare strato inferiore (acquoso) • Esaminare sedimento goccia a goccia sotto al microscopio • Possibilità di colorazioni temporanee

Preparazione di uno striscio fecale 19 • Lo striscio deve essere sottile e ben aderente al vetrino: si può aggiungere una goccia di siero per aumentare l’aderenza o alginato di Na che a contatto con fissatori acidi forma una pellicola gelificata che agisce da collante [sciogliere 2 g alginato di Na + 0, 6 g di Na. Cl in 100 ml d. H 20] • Diluire campione di feci (se troppo solido) in una goccia di soluzione fisiologica o direttamente con una goccia di soluzione acquosa di alginato di Na. • Strisciare il campione con un vetrino coprioggetti in modo da ottenere un monostrato: più lenta è la strisciata, più sottile è il preparato • Fissare e colorare il preparato prima che si secchi. FISSATIVI di elezione: Schaudinn acetico: - 2 vol sublimato soluz satura - 1 vol 95% Et. OH - all’impiego aggiungere 5% in volume di Acido acetico glaciale - lasciare agire per 1 ora Bouin: - 300 ml soluz. Satura di Ac picrico - 100 ml Formalina - 20 ml Acido acetico glaciale - lasciare agire per 30’

Tecniche di colorazione permanente di strisci fecali Tricromica • Striscio fresco • 1’ in Et. OH 70% iodato • 1 -5’ in Et. OH 70% (x 2) • 2 -8’ in Tricromica • 1 -3” in Et. OH 90%/Ac acetico (99. 5 Et. OH + 0. 5 Ac acetico gl) • 1 -3” in Et. OH 95% (x 2) • 1’ in Carboxilolo • 1 -3’ Xilolo • Montare il coprioggetti • Osservare al microscopio 20 Più adatta per FLAGELLATI. Citoplasma trofozoiti: blu-verde Cisti: leggermente violacee Nuclei e inclusioni: rossi-violacei Sfondo: verdastro Più adatta per AMEBE. Ematossilina ferrica Molto laboriosa (2 gg) Esistono versioni semplif. Citoplasma: grigio Nuclei, flagelli: neri Sfondo: bianco-grigio Colorazione di Kinyoun Carbol fucsina basica Acido solforico Blue di metilene 1% o verde luce 5% Più adatta per SPOROZOI Oocisti: rosso Sfondo e lieviti: blu o verde E’ possibile effettuare alcune colorazioni su materiale fissato in PVA, ma occorre variare i tempi di colorazione.

Tecniche più specifiche per campioni fecali positivi x PROTOZOI Su campioni fecali (NON FISSATI CON FORMALINA) previamente trovati positivi in seguito all’applicazione di metodi fisici o difasici generici possono essere eseguite ulteriori indagini specifiche: Ricerca di amebe: emulsionare 2 mg feci con una goccia soluz fisiologica su vetrino portaoggetti; coprire con coprioggetti (22 x 22) e premere; osservare eventuale movimento trofozoiti (10 o 40 X): E. histolytica emette pseudopodi unidirezionali. Coprocoltura: per ottenere un numero maggiore di protozoi, su cui effettuare analisi morfologiche e ricerche specifiche. • Tutti i protozoi intestinali, ad eccezione di Giardia, crescono bene sugli stessi terreni di coltura (es terreno di ROBINSON); • E. histolytica (ceppo patogeno) cresce più facilmente di altre Entamebe a T = 37°C; • Terreno di PAVLOVA, specifico per E. histolytica ; • Terreno di STONE per trasformazione di trofozoiti di E. histolytica in cisti. Colorazioni permanenti: Ematossilina ferrica, Tricromica; Giemsa 4%. 21

Tecniche più specifiche per campioni fecali positivi x ELMINTI Su campioni fecali (NON FISSATI CON FORMALINA) previamente trovati positivi per uova o larve di elminti in seguito all’applicazione di metodi fisici o difasici generici è possibile effettuare: Analisi QUANTITATIVE per valutare la CARICA PARASSITARIA utile per: • indagini epidemiologiche; • scelta della terapia; • valutazione efficacia del trattamento. Attenzione: il N° delle uova può variare da giorno ed in rapporto all’età del parassita e alla carica parassitaria. Diafanizzazione di KATO. Metodo di Stoll (modificato) Coltura su carbone attivo di uova di Strongyloides, Ancylostoma, Necator, Tricostrongylus non sono facilmente identificabili. L’dentificazione si compie su larve di III stadio rabditoiodi. 22

Tecniche più specifiche per campioni fecali positivi x ELMINTI Diafanizzazione di KATO (SOLO per UOVA di ELMINTI). • Filtrare 50 mg di feci fresche attraverso filtro di nylon (Ø maglie 220 µm); • Porre il prodotto filtrato su un vetrino portaoggetti; • Ricoprire con rettangolo 25 x 30 mm di cellophane trasparente idrofilo (conservato in soluzione acquosa al 50% di glicerina e 3% di verde di malachite); • Capovolgere il vetrino e schiacciarlo contro carta da filtro disposta su una superficie piana per ottenere una distribuzione omogenea; • Ottenere tra vetrino e cellophane un medaglione del diametro di circa 15 -20 mm; • Rigirare il vetrino e lasciare riposare per 45’ (l’acqua evapora e la glicerina si concentra gradualmente diafanizzando il sottile strato di feci); • Contare uova al microscopio applicando fattore di moltiplicazione (da 1 a 3). • Metodo di Stoll (modificato) • Porre 14 ml Na. OH 0. 1 N in provetta graduata e aggiungere feci fino a Vol = 15 ml; • Agitare e lasciare riposare per > 1 ora; • Agitare e prelevare velocemente 150 µl di sospensione a centro della provetta; • Trasferire su portaoggetti, ricoprire con coprioggetti e contare uova (N° uova x 100 = N° uova/15 ml = N° uova/gr feci). 23

Pictures of Ascaris lumbricoides with: 1) Kato-Katz thick smear, 2) Mc. Master method, 3) Mini-FLOTAC FS 2 and 4) Mini-FLOTAC FS 7.

modified Ziehl-Neelsen staining method (fuschin followed by methylene blue),

Ameba: life cycle

Entamoeba histolytica I trofozoiti sono responsabili delle lesioni anatomiche a danno della mucosa intestinale e che possono complicarsi con localizzazione extraintestinale Due forme di trofozoiti: • una fase vegetativa commensale (12 -25µm di diametro): “FORMA MINUTA”, osservabile nei portatori asintomatici • una fase vegetativa patogena (50 -60µm): “FORMA MAGNA”, potenzialmente invasiva e con attività fagocitaria (eritrociti)

Forma magna Per motivi non ancora del tutto chiari i trofozoiti di Entamoeba histolytica possono passare dal regime di vita commensale a quello parassitario, trasformandosi nella forma istolitica o forma magna di dimensioni maggiori (fino a 50 micron).

Forma magna Le forme istolitiche sono molto più attive e, a contatto con la mucosa intestinale la penetrano, per giungere in contatto con il sangue di cui fagocitano i globuli rossi causando ulcere.

Forma magna Con la circolazione sanguigna possono essere trasportati verso il fegato, i polmoni e, seguendo la grande circolazione, arrivare in qualsiasi altra localizzazione, causando i cosiddetti ascessi amebici (epatici, polmonari e cerebrali).

Pathogenesis of Invasive Amebiasis

Entamoeba histolytica Infezione primaria (intestinale): accrescimento sulla mucosa e distruzione dei batteri nell’intestino. Invasione dei tessuti, erosione tissutale e formazione di ulcere, raggiungimento della submucosa e dei vasi sanguigni, perforazione del colon, peritoniti e morte.

Mix PCR: • DNA precedentemente estratto; • Primers; • Nucleotidi; • Taq; • Mg. Cl 2, Buffer, H 2 O

Corsa elettroforetica su gel d’agarosio 1 2 3 4 5 6 + - M 500 bp Visualizzazione bande di DNA con UV

DIAGNOSI MOLECOLARE DI Entamoeba E. histolytica E. dispar Linee da 1 - 4: Amplificazione con Primers specifici per E. histolytica. Banda diagnostica 876 bp. Linee da 6 - 9: Amplificazione con Primers specifici per E. dispar Banda diagnostica 876 bp. Lanes 1 and 6: E. histolytica (controllo positivo per E. histolytica). Lanes 2 and 7: E. dispar (controllo positivo per E. dispar). Lanes 3 and 8: Campione da un paziente con un ascesso al fegato (positivo con primers per E. histolytica e negativo con primers per E. dispar ). Lanes 4 and 9: Campione da un paziente asintomatico (positivo con primers per E. dispar e negativo con primers per E. histolytica ). Lane 5: Marcatore molecolare 100 -bp

Cryptosporidia

Cryptosporidia: diagnosis • oocysts (4 -6 um) in fecal smear – red color in acid-fast stain – dark granules – also IF stain • small bowel biopsy

Cryptosporidium parvum stadio: cisti colorazione: Modified Kinyoun's Acid Fast Stain

PCR-RFLP diagnostica per differenziare isolati di Cryptosporidium

Ciclo biologico di Giardia intestinalis

Giardia intestinalis stadio: cisti colorazione: Faecal Trichrome

Crypto-Cel FITC Stain

Diphyllobothrium latum Le uova misurano 30 -50 µm. Le proglottidi gravide non vengono rilasciate dalle strobilo e le uova opercolate vengono emesse attraverso il poro uterino, più di un milione al giorno per verme

Botriocefalosi - epidemiologia La botriocefalosi è una ZOONOSI L’infestazione da Diphyllobothrium latum è diffusa nelle regioni del mondo dove laghi e fiume coesistono con il consumo di pesce d’acqua dolce crudo o poco cotto. Europa, alcuni stati dell’ex Unione Sovietica, Nord America, Asia e in Uganda e Cile (10 milioni di persone infette).

Botriocefalosi - epidemiologia In Italia era abbastanza frequente, soprattutto nella zona dei grandi laghi del nord (Maggiore, Como, d’Iseo, di Garda.

Botriocefalosi - sintomi La presenza del parassita adulto nell’intestino dell’uomo di solito non dà luogo a sintomi. Possono comparire disturbi aspecifici a carico del tubo digerente: astenia, addominalgie, costipazione, diarrea. Se si localizza nel digiuno, può provocarente assorbimento di vitamina B 12 (acido folico) il quale a sua volta è responsabile della comparsa di una forma di anemia detta perniciosa. Questo quadro morboso è presente con maggiore frequenza nella popolazione finlandese a causa di una predisposizione genetica all’ anemia perniciosa.

Complicazione: anemia – assorbimento vitamina B 12

DIAGNOSI La diagnosi di sospetto si basa sull’osservazione dell’eventuale sintomatologia (anemia perniciosa) la diagnosi di certezza, si ricorre all’impiego dell’ esame coprologico che consente l’individuazione delle uova del parassita. CONTROLLO Il congelamento del pesce per almeno 24 ore, la cottura completa, la conservazione sottaceto o in salamoia uccidono gli spargani. Allevamenti di pesci d’acqua dolce non devono entrare in contatto contaminazione fecale animale e impianti fognari

Sparganosi (forme larvali di Dyphillobothrium) L’uomo e gli altri ospiti definitivi si infettano ingerendo i crostacei che albergano la larva di Dyphillobothrium. La larva lascia rapidamente l’intestino e migra nei tessuti del sottocutaneo dove matura in plerocercoide. Presenza di noduli. Terapia solo chirurgica

In T. solium le proglottidi gravide escono dall’ospite con le feci In T. saginata possono abbandonare l’ospite singolarmente o a piccoli gruppi perché dotate di contrazioni che gli permettono di forzare lo sfintere anale.

Cisticercosi (forme larvali di Taenia solium) Da un punto di vista epidemiologico l’infestazione da cestode adulto e la cisticercosi si manifestano parallelamente.

Cisticercosi (forme larvali di Taenia solium) Il fattore di rischio principale per la cisticercosi è: 1. esistenza di una storia di teniasi, 2. consumo frequente di carne di maiale, 3. basso livello di igiene personale e dell’ambiente.

Cisticercosi (forme larvali di Taenia solium) • La fase iniziale è generalmente asintomatica. La gravità del quadro clinico dipende dal numero, localizzazione e vitalità delle cisti e dalla risposta immunitaria del soggetto infetto.

Cisticercosi (forme larvali di Taenia solium) • La neurocisticercosi esordisce con crisi epilettiche. I sintomi si possono osservare fino a 30 anni dall’infestazione. • Nel 25% delle persone, il parassita si localizza nell’occhio.

Cisticercosi (forme larvali di Taenia solium) • La diagnosi clinica si può eseguire su quattro caratteristiche di base presenti separatamente o in diverse combinazioni: eplilessia, sindrome meningoencefalitica associata a febbre, mal di testa e vomito, ipertensione intracranica e disturbi mentali.

Uovo di Hymenolepis nana

Clonorchis sinensis e Opistorchis spp.

Fasciola hepatica

Fasciolopsis buski

Uova di Schistosoma mansoni S. haematobium e S. japonicum

Tre fasi patogene di Schistosoma spp. 1. Penetrazione delle cercarie 2. Migrazione dello schistosomulo 3. Uova

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