Tecniche della Biologia Molecolare Amaldi Cap 21 vari

Tecniche della Biologia Molecolare Amaldi Cap 21 (vari paragrafi) Allison Cap 8 e 9 (vari paragrafi)

Uso di sonde di DNA per l’identificazione e l’analisi di sequenze nucleotidiche • Ibridazione üA saturazione üIbridazione in situ o citologica üSouthern e Northern Blot üIbridazione su colonia o su placca üMicroarray (o microchip)

Ibridazione in situ o citologica

Microarray

Tecnologie di base per l’isolamento e la manipolazione dei geni Ingegneria genetica o Tecnologia del DNA ricombinante • Enzimi di restrizione e DNA Ligasi • Vettori di clonaggio • Plasmidi • Trasformazione di cellule di E. coli e selezione dei trasformanti • Plasmidi della serie p. UC: selezione blu bianco • Vettori di espressione e produzione di proteine ricombinanti • Batteriofago Lamda • Cosmidi • Vettori per il clonaggio e l’espressione in cellule eucariotiche • Vettori di lievito • Vettori per il trasferimento genetico in cellule animali • Trasferimento di DNA all’interno di Vegetali

Clonaggio

Enzimi di restrizione e DNA Ligasi

Vettori di Clonaggio • • Plasmidi Cosmidi Fagi Cromosomi artificiali: ü Lievito (YAC) ü Batterici (BAC) ü Plasmidici (PAC) • Vettori di espressione in Procarioti, Eucarioti, Piante • Virus

Vettori di Clonaggio

Plasmidi della serie p. UC: selezione blu bianco

Vettori di Espressione: E. Coli

Batteriofago Lamda

Cosmide

Vettori di Lievito: vettori plasmidici

Vettori di Lievito: YAC

Banche di DNA – DNA library • Banche genomiche • Rappresentatività di una libreria di DNA genomico • Libreria di c. DNA • Identificazione del clone contenente il DNA di interesse da una libreria

PCR – Reazione a catena della polimerasi • Polymerase Chain Reaction (Mullis, 1983) • Taq Polymerase • Ciclo di PCR: üDenaturazione del DNA üAssociazione (Annealing) degli inneschi (primer) üSintesi da parte della polimerasi

• Ciclo di PCR: üDenaturazione del DNA: 30 sec a 95° üAssociazione (Annealing) degli inneschi (Primer) 30 sec a 40 -60°C per favorire l’associazione specifica degli inneschi (La temperatura deve essere di circa 5°C al di sotto della Tm degli inneschi) üSintesi da parte della polimerasi: 2 min a 72°C che è la temperatura ottimale per la Taq polimerasi

RT-PCR & Real Time PCR • RT-PCR = PCR su un campione di DNA retrotrascritto a partire da RNA mediante Reverse Transcriptase • Real Time PCR = PCR in tempo reale, per l’analisi degli amplificati (quantità) durante l’amplificazione,

Real Time PCR

Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA • Metodo chimico (Maxam & Gilbert) • Metodo enzimatico (Sanger)

Principio del seq

Metodo chimico - Maxam & Gilbert

Metodo enzimatico - Sanger

piattaforme di sequenziamento di nuova generazione - NGS In Uso • Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX di Roche • Piattaforma Illumina – Genome Analyzer • Sistema SOLi. D – Applied Biosystem Altre • Helicos Biosciences • ION Torrent

Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX di Roche

Piattaforma Illumina – Genome Analyzer

Sistema SOLi. D – Applied Biosystem

Campi applicazioni NGS • Sequenziamento de novo e risequenziamento di genomi complessi • Identificazione di siti polimorfici e mutazioni • Analisi del trascrittoma • Studio dell’Interazione DNA- Proteine • Caratterizzazione del metiloma e studio dell’editing • Metagenomica

21. 9 Valutazione dell’espressione di un gene

21. 10 Inibizione dell’espressione di geni specifici • RNA antisenso • Intereferenza da RNA