TECNICAS DE MANIPULACIN DEL ADN SECUENCIACIN DEL ADN

TECNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN • SECUENCIACIÓN DEL ADN • FORMACIÓN DE MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINANTE • SÍNTESIS DE ADN COMPLEMENTARIO • SÍNTESIS DE ADN DE NOVO (SINTÉTICO) • HIBRIDACIÓN DE AC. NUCLEICOS • GENOTECAS DE ADN • REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

BIOTECNOLOGÍA: Conjunto de técnicas mediante las que se obtienen Productos útiles para las personas a partir de los seres vivos, sus partes o sus productos. http: //www. porquebiotecnologia. com. ar/index. php? action=recursos&opt =4&note=90&id=4 La INGENIERÍA GENÉTICA es una rama moderna de la biotecnología

INGENIERÍA GENÉTICA CONSISTE EN LA ALTERACIÓN ARTIFICIAL Y DELIBERADADEL GENOMA DE UN SER VIVO, MODIFICÁNDO DIRECTAMENTE SU ADN. Para ello se aplican los métodos y TECNICAS DEL ADN RECOMBINANTE

SECUENCIACIÓN DEL ADN Ø Permiten conocer la secuencia de nucleótidos. Ø Se identifican las secuencias codificadoras de proteínas y las secuencias reguladoras de la expresión del gen. Ø Así se puede deducir la secuencia de aa de la proteína codificada

FORMACIÓN DE MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINANTE El ADN Recombinante son moléculas resultantes de la unión del gen elegido y el vector adecuado para su transporte. 1. CORTE DE FRAGMENTOS DE ADN 2. SEPARACIÓN DE LOS FRAGMENTOS 3. UNIÓN AL VECTOR DE TRANSPORTE

1. CORTE DE FRAGMENTOS DE ADN • Producido por las endonucleasas de restricción bacterianas en las secuencias de reconocimiento (palindrómicas). • Producen extremos romos o pegajosos (cohesivos)

2. SEPARACiÓN DE LOS FRAGMENTOS DE ADN ELECTROFORESIS EN GEL (Agarosa o poliacrilamida) Ø Los fragmentos originados migran por el gel cuando se aplica el campo eléctrico atendiendo a su tamaño. Ø Cuanto más pequeños más migran Ø Se originan diferentes bandas

3. UNIÓN AL VECTOR Generalmente los vectores son PLÁSMIDOS (20 o 50 2 n una bactería. Con origen de replicación independiente) GENOMAS VÍRICOS DE ADN( Virus bacteriófagos, el más común el fago ) CÓSMIDOS (plásmido especial que se introduce en el fago lambda, infecta a bacterias y una vez dentro de estas se recirculariza de nuevo en forma de plásmido) ADN SINTÉTICO (ADN sintetizado expresamente para unirse al gen elegido El vector también es cortado por las mismas endonucleasas para originar extremos cohesivos idénticos y después estos son unidos por la ADN ligasa por enlaces covalentes. Se obtiene así el ADN recombinante

SÍNTESIS DE ADN COMPLEMENTARIO (ADNc) • Se usa como molde el ARNm porque ya está maduro y no presenta intrones. • Es necesaria la TRANSCRIPTASA INVERSA para sintetizar el ADN complementario al ARNm • Del ADN que se obtiene se fabrica otra cadena complementaria para tener una doble cadena.

SINTESIS DE ADN DE NOVO: ADN SINTÉTICO • Se sintetiza de novo un ADN cuya secuencia se conoce (100 nucleótidos más o menos) • Extremo 3´fijo a un soporte fijo (gel de sílice) • Se van añadiendo nucleótidos activados al extremo 5´. • Al final se separa por centrifugación o filtración y se repite el proceso para añadir otro nucleótido. • Esto es realizado por máquinas llamadas SINTETIZADORES DE ADN

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS • Mediante desnaturalización 1º y después renaturalización se pueden obtener hebras híbridas de cualquier tipo de Ácido Nucleico. • Generalmente se quieren localizar genes en los cromosomas o en regiones de estos. Se emplean SONDAS que pueden ser de ADN o de ARN. • Hibridación ADN-ADN Transferencia tipo Southern • Hibridación ADN-ARN Tecnica de transferencia de tipo Northern

GENOTECAS DE ADN • Genes aislados e identificados de un ADN. Se introducen en bacterias y se guardan para su utilización cuando sea necesario. Como si fuesen libros. Los investigados los toman cuando les es necesario. • También existen genotecas formadas por ADNc

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) • Permite conseguir muchas copias de un fragmento de ADN aunque haya poca cantidad sin usar células vivas. El ADN que se quiere copiar se desnaturaliza (100ºC). Se obtienen dos cadenas que sirven de molde para sintetizar otras complementarias. Para que la ADN polimerasa las sintetice necesitamos unos cebadores adecuados y una concentración suficiente de nucleótidos trifosfato. Esto es un ciclo simple. Si lo repetimos, tendremos 4 cadenas tras la desnaturalización que podrán duplicarse creando sus complementarias y así sucesivamente. Es un proceso exponencial. TERMOCICLADORES Esto es un proceso sistematizados. Las ADN polimerasas proceden de bacterias termófilas (pq funcionan a altas Tª)

GENÓMICA Y PROTEÓMICA • Objeto de estudio de la GENÓMICA es el conocimiento del genoma completo y de las interacciones que tiene los genes que lo componen • El término proteoma se utiliza para designar el conjunto de las proteínas de un genoma, una célula o un tejido. Del proteoma surge PROTEÓMICA. Disciplina que realiza un estudio sistemático del conjunto completo de proteínas codificadas por un genoma