Technologies et biotechnologies vgtales MarieFranoise Niogret Antoine Gravot

Technologies et biotechnologies végétales Marie-Françoise Niogret Antoine Gravot UMR 6026 Interactions Cellulaires et Moléculaires S 7 : Technologie et biotechnologie végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Transformation de matière première en biens ou services par le moyen d’organismes vivants » Fermenteurs Bioréacteurs

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Technologies impliquant l’obtention et/ou l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés »

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Technologies innovantes basées sur des connaissances scientifiques dans le domaine du vivant, impliquant d’importants investissements en R&D et une large ambition commerciale» Meristem Therapeutics Bretagne Biotechnologies Végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies végétales « Développement et utilisation de techniques de cultures in vitro dans différents domaines relatifs au végétal et à l’amélioration variétale» l l l l Haplodiploïdisation Culture de méristèmes Micropropagation Sauvetage d’embryons Fusion de protoplastes Création de variabilité Banque de germoplasmes … www. srpv-bretagne. com

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies « Développement et application d’outils moléculaires dans différents domaines relatifs à l’agronomie et la médecine » • Science Museum/Science & Society Picture Library

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Définitions l Issues du génie des procédés (école allemande) – Définition historique (Karl Ereky), début XXème l l – l Mots clés : génie des procédés, production industrielle Issues du génie génétique (école américaine) – Depuis les années 70 l – « Utilisation des techniques de l’ADN recombinant » Mots clés : ADN recombinant, protéines hétérologues, organismes génétiquement modifiés l l Production de biens à partir de matière première en utilisant des organismes vivants Utilisation des techniques de fermentation et dérivées Gerard Siclet : Technologies de pointe mettant en œuvre des processus cellulaires ou moléculaires, grâce au génie génétique Plaçant au premier plan les applications industrielles et commerciales – Définition OCDE 1980 : Mise en œuvre de matériel biologique pour la production de biens et de services l En Europe : définitions concernant spécifiquement le végétal et insistant soigneusement sur les technologies ne faisant pas appel à la transgenèse l Plus récemment : définitions incluant les approches de génomique

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Biotechnologies végétales : Domaines abordés dans ce cours : Ensemble de pratiques l faisant appel aux cultures in vitro de plantes et aux techniques de biologie moléculaire dans les domaines de l’agronomie, l’industrie et la recherche fondamentale Recherche fondamentale Agronomie : Création variétale, Multiplication conforme, Identification variétale… Cultures in vitro Biologie moléculaire Industrie Production de composés ou de protéines d’intérêt alimentaire et non-alimentaire

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Au programme… l Les cultures in vitro – – – Totipotence de la cellule végétale Techniques de base de culture in vitro Applications technologiques: l – Applications en recherche : l l micropropagation, sauvetage d’embryon, haplo/diploïdisation, fusion de protoplastes… signalisation, adressage de protéines, échanges d’ions et de métabolites Biotechnologie moléculaire – – – Bases de la transgenèse des végétaux MF Niogret Applications en agriculture conventionnelle Applications dans la valorisation non alimentaire des productions végétales l l l Production de protéines recombinantes Production de métabolites secondaires Phytoremédiation

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Les travaux pratiques l l l Rôle des substances de croissance dans l’organogenèse et composition des milieux de culture Préparation et fusion de protoplastes Caractérisation et phénotypage de mutants d’Arabidopsis

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Les travaux dirigés l Préparation d’un exposé concernant un domaine de la biotechnologie végétale l Réalisation d’un dossier concernant un gène chez Arabidopsis thaliana – – – Expression tissulaire, régulation, fonctions connues Brevets Démarche concrète d’obtention de mutants

Totipotence chez le végétal Signification et limites S 7 : Technologie et biotechnologie végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Plan l l l Quelques définitions Naissance et développement des cultures in vitro Applications et limites de la totipotence Mécanismes sous-jacents à la totipotence Signification biologique de la totipotence des cellules végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Quelques définitions l Chez les plantes, la totipotence peut se définir comme la propriété qu’ont certaines cellules de pouvoir régénérer un individu lorsqu’elles sont placées dans des conditions appropriées, en passant éventuellement par une étape de dédifférenciation Spécificité du végétal Chez les animaux l Cellules totipotentes: cellules issues des premières division de l'oeuf fécondé capables de donner naissance à tous les types de cellules de l'organisme et les seules à permettre le développement complet d'un individu. l Cellules pluripotentes : Capacité que possède une cellule de se différencier en environ 200 types cellulaires représentatifs de l’ensemble des tissus (cellules souches embryonnaires issues d’embryons de 5 à 7 jours) l Cellules multipotentes : capables de donner naissance à plusieurs types cellulaires (les cellules souches myéloïdes de la moelle osseuse sont à l’origine des cellules sanguine)

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Exemple : microbouturage du Saint Paulia 2 mois plus tard Source : http: //www. didier-pol. net/1 CLONES. html

Historique La totipotence comme fil conducteur de la naissance des biotechnologies végétales S 7 : Technologie et biotechnologie végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Historique de la culture de tissus et d’organes de plantes l Contexte théorique au début du XXème siècle: – Théorie cellulaire (Schleiden et Schwann) Comment étudier le comportement de cellules isolées ? – Microbiologie et biochimie Cultures en conditions stériles Caractérisation de substances de croissance

Aspects historiques S 7 : Technologie et biotechnologie végétales G. Haberlandt : le concept de totipotence de la cellule végétale Deux idées importantes : • la culture de cellules isolées constituerait potentiellement un modèle de recherche • maintient en vie de cellules isolées • Pas de multiplication cellulaire http: //users. ugent. be/~pdeberg h/his 2 az 1. htm • on peut potentiellement régénérer une plante entière à partir d’une cellule isolée totipotence • Échec (mauvais choix d’explants, méconnaissance des substances de croissance)

Aspects historiques S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Émergence des techniques de culture – – Haberlandt (1902) : concept de totipotence White (1934) : culture in vitro de racines de tomates Gautheret (1935) : utilisation d’auxine pour cultiver du cambium de saule 1939 : 1ère culture indéfinie de cals de carotte https: //www 2. carolina. com La culture de tissus est possible en utilisant des substances de croissance et/ou des tissus méristématiques

Aspects historiques S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Émergence des techniques de culture – Braun (1941) : travaux sur le crown gall Croissance in vitro des tumeurs sans ajout d’hormones – – Miller (1955) : cytokinines Murashige et Skoog : mise au point de milieux de culture efficaces contenant des cytokinines et des auxines

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Confirmation des hypothèses d’Haberlandt l 1956 (Muir) suspensions cellulaires l 1958 (Reinart et Stewart) Embryogenèse somatique chez la carotte Aspects historiques

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Confirmation des hypothèses de Haberlandt l 1965 (Vasil et Hilderbrandt) Régénération d’un plant de tabac à partir d’une cellule unique l 1971 (Nagata et Takabe) Régénération d’un plant entier à partir d’un protoplaste

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Développements : des outils agronomiques l 1965 (Morel) multiplication in vitro des orchidées l 1972 (Sharp) : tomates haploïdes à partir de pollen l 1973 : hybride issu d’une fusion de protoplastes Aspects historiques

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Développements : production de métabolites secondaires l 1977 : culture de cellules de tabac dans un réacteur de 20 000 litres l 1983 (Mitsui Petrochemical) : production industrielle de métabolites secondaires

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Développements : la transgenèse l Van Montaigu (1983) : tabac résistant à la kanamycine l 1994 : Flavr Savr (Calgene, antisensage d’une polygalacturonase) l 1996 : maïs transgénique commercialisé aux USA

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques Conclusions l Problématique initiale : – – recherche d’un modèle de cellules isolées démonstration de la totipotence des cellules végétales Identification du rôle des substances de croissance Mise au point de nombreuses techniques Transgénèse

La totipotence : applications et limites S 7 : Technologie et biotechnologie végétales

Principales méthodes de micropropagation Meristème Culture de méristème Apex caulinaire Nœud Tige feuillée Caulogenèse directe Morphogenèse directe Embryogenèse somatique directe Explants divers (racines, tige, feuilles…) cal Morphogenèse indirecte Callogenèse D’après Lindsey et Jones 1989 Enracinement Plantules Semences artificielles Caulogenèse indirecte Embryogenèse somatique indirecte Suspensions S 7 : Technologie et biotechnologie cellulaires végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Des cellules plus ou moins totipotentes Les méristèmes : • un réservoir de cellules totipotentes Les autres types cellulaires : • une totipotence plus ou moins facile à exprimer • Utilisation de substances de croissance exogènes • Régénération directe Variabilité interspécifique • Régénération en passant par un stade de cal

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Limites de la totipotence : impossibilité technique l l l Différentiation irréversible : xylème (!) En fonction de la méthode de préparation des protoplastes, récalcitrance à la régénération Pour beaucoup d’espèces d’intérêt agronomique, les protoplastes ne sont pas totipotents (récalcitrants) ex : Vitis vinifera

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Limites de la totipotence : l Variation somaclonale Les plantes régénérées présentent souvent des problèmes – – l Perte de caractères chimériques Aneuploïdies , délétions chromosomiques Modification du caractère juvénile – Impact sur la fertilité

Mécanismes sous-jacents à la totipotence Chez les cellules végétales S 7 : Technologie et biotechnologie végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Pourquoi les cellules végétales sont totipotentes : Arguments classiques l l Petit nombre de types cellulaires Seulement 3 ou 4 types d’organes fondamentaux (racine, tige, feuilles) dont les fleurs, vrilles, épines, fruits et tubercules sont des dérivés l Grande plasticité génomique – la croissance peut rester presque normale malgré de profonds remaniements chromosomiques

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Etapes liées à la totipotence l Etape 1 : – – l Cellules différentiées : dédifférenciation nécessaire Cellules souches méristématiques Etape 2 : mise en route de l’activité mitotique utilisation de substances de croissance l Etape 3 : autonomie de la croissance tissulaire vis-à-vis des substances de croissance exogènes Enjeux scientifiques actuels: Comprendre les mécanismes de dédifférenciation Comprendre la nature des cellules souches

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Comprendre les mécanismes de dédifférenciation l Modulation de l’expression génétique via des mécanismes épigénétiques – Reconformation de la chromatine l l Modification des histones Méthylation de l’ADN

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Comprendre la nature des cellules souches l l Notion de cellule souche en biologie végétale Notion de niche de cellule souche en biologie végétale

Signification de la totipotence Pourquoi les cellules de plantes sont-elles totipotentes ? S 7 : Technologie et biotechnologie végétales

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Signification de la totipotence F. Hallé : la totipotence est une spécificité des organismes autotrophes fixés On retrouve la totipotence des cellules chez les coraux quels sont les autres points communs coraux / plantes ?

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Signification de la totipotence Points communs coraux/plantes Croissance indéfinie Zones méristématiques Morphologie type « fractales » Autotrophie, faible flux énergétique Vie fixée Durée de vie potentiellement illimitée Squelette de nature excrémentielle

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Deux contraintes : Autotrophie : Faible flux énergétique • maximisation de la surface dans l’espace Signification de la totipotence Développement en axes ramifiés • croissance verticale Lutte contre la croissance homothétique

Signification de la totipotence S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Deux contraintes : Autotrophie : Faible flux énergétique • maximisation de la surface dans l’espace Développement en axes ramifiés • croissance verticale Lutte contre la croissance homothétique Développement indéfini à partir des méristèmes Totipotence des cellules méristématiques

S 7 : Technologie et biotechnologie végétales Fonctions biologiques de la totipotence • Architecture adaptée à l’autotrophie • Réactivité du développement dans un contexte de vie fixée • Multiplication végétative