TECHNOLOGIE DE LADN RECOMBINANT La technologie de lADN
TECHNOLOGIE DE L’ADN RECOMBINANT
La technologie de l’ADN recombinant a révolutionné l’étude de la cellule en permettant aux chercheurs de choisir à volonté n’importe quel gène parmi les milliers d’une cellule et après une étape d’amplification, de déterminer la structure moléculaire exacte du gène. Les possibilités de manipulation du matériel génétique et des approches thérapeutiques qui y correspondent en découlent
Les étapes principales de la technologie de l’ADN recombinant. 1869 Miescher isolait l’ADN pour la première fois. 1944 Avery apportait la preuve que l’ADN plutôt que les bactéries porte l’information génétique au cours de la transformation bactérienne. 1953 Watson et Crick proposaient un modèle en double hélice pour la structure de l’ADN, basé sur des résultats obtenus par Franklin et Wilkins avec les rayons X. 1957 Kornberg découvrait l’ADN polymérase, l’enzyme aujourd’hui utilisé pour reproduire des sondes d’ADN hautement radioactif. 1961 Marmur et Doty découvraient la renaturation de l’ADN, établissant ainsi la spécificité et la faisabilité des réactions d’hybridation d’acides nucléiques.
1962 Arber a mis en évidence pour la première fois l’existence des enzymes de restriction de l’ADN ; cela aboutit par la suite à leur purification et à leur utilisation dans la caractérisation des séquences d’ADN par Nathans et H. Smith. 1966 Nirenberg, Ochoa et Khorana élucidaient le code génétique. 1967 Gellert découvrait l’ADN ligase, l’enzyme utilisé pour relier des fragments d’ADN. 1972 -1973 Les techniques de clonage de l’ADN étaient mises au point par les laboratoires de Bayer, Cohen, Berg et leurs collègues à la Stanford University et à l’University of California à San Francisco. 1975 -1977 Sanger et Barrell et Maxam et Gilbert développaient des méthodes rapides pour déterminer la séquence de l’ADN. 1981 -1982 Palmiter et Brinster produisaient des souris transgéniques. Spradling et Rubin produisaient des drosophiles transgéniques.
Technologie de l’ADN recombinant Ø Nucléases de restriction F clivage ADN isolement et manipulation de gènes u Séquençage rapide F F détermination de l’enchaînement des nucléotides définition de séquences protéiques u Hybridation des acides nucléiques appariement base à base très précis et très sensible. u Clonage d’ADN F ADN choisi intégré dans élément auto répliquant : virus ou plasmide inclus dans une bactérie. production industrielle de protéines recombinantes u Génie génétique F F remaniement de gènes cellules ou organismes génétiquement modifiés.
Technologie de l’ADN recombinant Un élément fondamental de cette technologie est la capacité à couper une grande molécule d’ADN en un groupe spécifique et reproductible de fragments par l’utilisation de nucléases de restriction
Enzymes de restriction u Fabriquées par les bactéries. u Reconnaissent des séquences de 4 à 8 nucléotides. u Protection des séquences identiques chez les bactéries par méthylation. u > 100 actuellement utilisable.
séquences nucléotidiques de l ’ADN reconnues par des nucléases de restriction couramment employées.
Fragments de restriction u Fragments d’ADN obtenus par action des enzymes nucléasiques. Analyse par électrophorèse en gel (polyacrylamide…) u Carte de restriction = classement par taille des fragments obtenus après action des enzymes de restriction sur une région ADN donnée. Localisation des sites de coupures u Ordre d’enchaînement des nucléotides. 2 avantages : comparaison de différentes régions d’ADN localisation u Extrémité des fragments (coupure en zig-zag) = extrémités cohésives.
Fragments de restriction u Fragments d’ADN obtenus par action des enzymes nucléasiques. Analyse par electrophorèse en gel (polyacrylamide…)
visualisation lumière fluorescente séparation autoradiographie
Northern, Southern blotting Buvardage ou transfert sur feuille de nylon ou de nitrocellulose des séquences d’ARN ou d’ADN présentes sur le gel de polyacrylamide. Incubation avec sondes radioactives dans les conditions d ’hybridation. Autoradiographie.
Fragments de restriction u Carte de restriction = classement par taille des fragments obtenus après action des enzymes de restriction sur une région ADN donnée.
Fragments de restriction u Extrémité des fragments (coupure en zig-zag) = extrémités cohésives.
Technologie de l’ADN recombinant isolement et manipulation de gènes Formation de molécules d’ADN recombinant in vitro
Technologie de l’ADN recombinant Ø Nucléases de restriction F clivage ADN isolement et manipulation de gènes u Séquençage rapide F F détermination de l’enchaînement des nucléotides définition de séquences protéiques u Hybridation des acides nucléiques appariement base à base très précis et très sensible. u Clonage d’ADN F ADN choisi intégré dans élément auto répliquant : virus ou plasmide inclus dans une bactérie. production industrielle de protéines recombinantes u Génie génétique F F remaniement de gènes cellules ou organismes génétiquement modifiés.
méthodes de séquençage des acides nucléiques u
méthodes de séquençage des acides nucléiques Utilisations F Séquences AA d ’une protéine. F Etudes séquences de régulation reconnues par des protéines de liaison à l’ADN.
Nucléotides de terminaison de chaîne anormaux (didexoxyribo) Synthèse de l’ADN in vitro Séparation des produits des 4 réactions par électrophorèse Détection des fragments par un marqueur (fluorescent ou radioactif) Analyse de la séquence par lecture dans l’ordre d’apparition
Technologie de l’ADN recombinant Nucléases de restriction F clivage ADN isolement et manipulation de gènes u Séquençage rapide F F détermination de l’enchaînement des nucléotides définition de séquences protéiques u Hybridation des acides nucléiques appariement base à base très précis et très sensible. u Clonage d’ADN F ADN choisi intégré dans élément auto répliquant : virus ou plasmide inclus dans une bactérie. production industrielle de protéines recombinantes u Génie génétique F F remaniement de gènes cellules ou organismes génétiquement modifiés.
Hybridation d’Acides Nucléiques. u 1ère étape : dénaturation (100° ou p. H ) 2ème étape : renaturation (65°) par hybridation des séquences complémentaires. u Vitesse d ’hybridation dépend de la vitesse à laquelle les 2 chaînes se rencontrent => mesure de la concentration de toute séquence choisie d’ADN ou d’ARN à l’aide de fragments mono caténaires ou sondes d’ADN (de 15 à plusieurs milliers de nucléotides) Réaction sensible et spécifique (détecte 1 mol/cellule).
Applications : recherche de séquence d’ADN spécifique identification gènes apparentés mais non identiques (souris - homme par exemple) étude de l’expression génique par appariement avec l’ARN : ARNm, épissage (introns), expression des gènes ; au cours de la différenciation et selon modulation ; identification des sites de modulation : traduction, transcription ou modulation ARN. diagnostic des maladies métaboliques recherche de gènes homologues (famille de gènes => famille de protéines) hybridation « in situ » : localisation de séquences dans les chromosomes ou l’ARN (cytoplasme). Le marquage chimique est > au marquage radioactif.
Technologie de l’ADN recombinant u Hybridation des acides nucléiques (utilise la possibilité d ’appariement base à base très précis et très sensible).
Technologie de l’ADN recombinant Nucléases de restriction F clivage ADN isolement et manipulation de gènes u Séquençage rapide F F détermination de l’enchaînement des nucléotides définition de séquences protéiques u Hybridation des acides nucléiques appariement base à base très précis et très sensible. u Clonage d’ADN F ADN choisi intégré dans élément auto répliquant : virus ou plasmide inclus dans une bactérie. production industrielle de protéines recombinantes u Génie génétique F F remaniement de gènes cellules ou organismes génétiquement modifiés.
Clonage de l’ADN Utilisation des extrémités cohésives => insertion du fragment d’ADN choisi dans le génome d’un élément génétique auto répliquant : plasmide ou virus bactérien. Inclusion du plasmide ou virus dans la bactérie => production en grande quantité de l’ADN choisi
Modes d’obtention de l’ADN Clones d’ADN génomique u Purification ADN génome entier u Clivage par enzyme de restriction = 105 à 107 fragments par génome de mammifère u Insertion dans bactéries millions de colonies cellulaires partout des clones u Sélection du clone intéressant Clones d’ADNc (forme ininterrompue de séquences d’ADN codantes) u Purification ARNm (ou sous-fractions) u Synthèse ADNc par transcription reverse => copie d’ADN complémentaire de chaque molécule ARNm u Doublage de l ’ADNc pour obtenir un ADN bicaténaire.
Insertion d’un fragment d’ADN dans un plasmide bactérien utilisation de l’ADN ligase
Clonage d’un fragment d’ADN
Construction d’une banque génomique humaine
Technique de détection d’une colonie bactérienne portant un clone particulier
Amplification de l’ADN par PCR
Utilisation de la PCR pour obtenir un clone génomique ou d’ADNc
Identification d’une contamination virale par PCR
Production industrielle de protéine recombinante
technique de génétique inverse 1) isolement protéine 2) clonage de la protéine séquençage modification => gène mutant 3) transfert dans une cellule intégration au chromosome par recombinaison génétique => cellule mutée. si cellule germinale => organismes transgéniques. Difficultés : ADN taille importante : pas de recombinaison mais insertion => expression des 2 protéines 1 normale et 1 mutée Solution : ARN antisens = mutation dominante.
principe de la génétique directe et de la génétique inverse
Technologie de l’ADN recombinant Nucléases de restriction F clivage ADN isolement et manipulation de gènes u Séquençage rapide F F détermination de l’enchaînement des nucléotides définition de séquences protéiques u Hybridation des acides nucléiques appariement base à base très précis et très sensible. u Clonage d’ADN F ADN choisi intégré dans élément auto répliquant : virus ou plasmide inclus dans une bactérie. production industrielle de protéines recombinantes u Génie génétique F F remaniement de gènes cellules ou organismes génétiquement modifiés.
Génie génétique modification de la séquence nucléotidique d’un ADN cloné puis insertion cellulaire à l’aide de vecteurs actuellement, il est en principe possible de construire un gène codant une protéine de n’importe quelle séquence d’AA liée à une séquence d’ADN promoteur qui permettra le contrôle du niveau et le mécanisme d’expression du gène. Insertion dans une cellule => modification du génome. Applications : immortalisation cellulaire thérapie génique.
Techniques de manipulation génétique (souris)
Thérapie Génique Définition utilisation des gènes comme médicament Application au traitement des maladies génétiques à toutes les affections acquises pouvant bénéficier du traitement par une protéine thérapeutique. Principe méthodologique purification de la protéine génie génétique puis thérapie génique
Thérapie Génique Méthodes de thérapie génique ? T. G. germinale (pas chez l’humain) T. G. somatique - autogreffe de cellules génétiquement corrigées (ex. vivo) - thérapie in vivo.
Thérapie Génique Vecteurs de la thérapie génique Particule virale ou non virale assumant le transport du gène et facilitant sa pénétration dans la cellule. Virus : suppression de gènes de pathogénicité insertion des gènes choisis rétrovirus => cellules se divisant mais transmission adénovirus => cellules latentes mais non transmission Liposome Cellules Nanoparticules
Virus, plasmides u Virus particules infectieuses molécule d’ADN ou d’ARN enfermée dans une capside protéique parfois une membrane à double couche lipidique = enveloppe). parasite obligatoire, se multiplie à l’intérieur de la cellule => lyse cellulaire et libération de particules virales. si intégration dans les chromosomes = provirus. thérapie in vivo (+ u Plasmides ADN ou ARN autorépliquant ne possédant pas de capsides u Eléments transposables séquence d’ADN ne se répliquant que dans la cellule cible ou ses descendants se déplace dans le génome = rétrovirus. responsables de réarrangements géniques (=> évolution)
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