Techniky molekulrn biologie a genetiky MUDr Michal Jurajda
Techniky molekulární biologie a genetiky MUDr. Michal Jurajda, Ph. D. 3. 4. 2015
Struktura genomu
Základní pojmy • Genom – kompletní genová výbava organismu • Gen – úsek řetězce DNA přepisovaný do RNA, včetně předcházejících následných a vložených úseků nezbytných pro realizaci genetické informace. • Lokus – místo, které zaujímá určitý gen na chromozomu • Alela – konkrétní forma genu
Genetika populací • Genofond – souhrn všech alel všech genů v určité populaci.
DNA • Jaderná • Mitochondriálni
Realizace genetické informace • Genotyp • Fenotyp
Organizace genomu
DNA
Genetický kód
• Genetický kód je univerzální • Genetický kód je „degenerovaný“
gen 5´ DNA 3´ Kódující vlákno Promotor 5´ Exon 1 Intron 1 E 2 I 2 E 3 3´ Exon 4 I 3 5´ templátové vlákno RNA 3´ Transkripce RNA 5´ transkript 1 5´UTR I 2 I 3 I 4 3´ Processing (capping, adice poly A, splicing) 1 Zralá m. RNA Cap Protein 5´UTR 1 NH 2 2 2 3 Translace 3 4 AAAAAn 3´UTR 4 COOH
Chromozóm
Karyotyp
Vlivy zevního prostředí • Mutace • Epigenetické efekty - methylace, acetylace DNA
Mutace
Základní pojmy • Gen • Alela
Mutace • Změna v genetickém kódu (v pořadí bází) v genetické výbavě jedince.
Příčiny vzniku mutací – Chyba při duplikaci DNA – Fyzikální vlivy (UV, ionizující záření) – Chemické mutageny – Viry – SHM (somatic hypermutation) proces diversifikace imunoglobulinových genů.
Typy mutací podle dědičnosti • Mutace somatické, nepřenosné na potomky (vyjímka rostliny) • Mutace zárodečné
Somatické mutace • Týkají se jedné somatické buňky • Pokud se buňka dělí může vzniknout klon buněk nesoucí danou mutaci. • Vznik nádorových klonů • Klonální diferenciace, selekce
Zárodečné mutace • Přítomné ve všech buňkách postiženého organismu • Přenosné na další generace
Vliv mutace na „fitness“ organismu • Je relativní s ohledem na zevní podmínky – Pozitivní – Negativní – Neutrální
Mutace a polymorfismy • Každá nová změna sekvence DNA v populaci se objevuje ve formě mutace. • Vyskytne se jen u jednoho jedince v populaci a pokud je zárodečná dostává se do dalších generací.
Mutace x polymorfizmy • Mutace – Selekce – Neutrální mutace – genetický drift • Genetické polymorfizmy – Populační četnost vzácnější alely aspoň 1%
Typy mutací podle změny struktury DNA • Bodové mutace – tranzice A G, C T – transverze A/G C/T
Bodové mutace v kódující oblasti genu • Silent mutations: kódují stejnou aminokyselinu • Neutral mutations: kódují podobnou aminokyselinu • Missense mutations: kódují jinou aminokyselinu • Nonsense mutations: kódují STOP kodon a zkracují protein
• Inzerce – Jedna nebo více bází – replikace repetitivních sekvencí, transpozony – Změna čtecího rámce – Splice site mutations • Delece – Změna čtecího rámce
Chromozomální aberace strukturální • • Amplifikace Delece Translokace Inverze • Fúzní geny: bcr-abl
LOH • Loss of heterozigosity • Ztráta heterozygotnosti – např. u nádorových bb.
Nomenklatura • DNA 76 A>C , 76_78 del , 76_77 ins. T • Protein M 235 T, ΔF 508 Jedinečný identifikátor rs 6200616 T
Monogenní a multigenní nemoci
Terminologie • Symptom – příznak (chorobný) • Syndrom – skupina příznaků • Nemoc jako nosologická jednotka – obvykle definována podle příznaků a příčin (etiologie) • Pojem normality
Nemoc • Nosologická jednotka popsaná deskriptivně a empiricky • Molekulárně patofyziologický děj, manifestující se různě za daných podmínek zevního prostředí
Dělení nemocí podle etiologických faktorů • Nemoci z vnějších příčin • Nemoci z vnitřních příčin • Choroby z jedné „velké“ příčiny • Multifaktoriální choroby
Nemoci z vnějších příčin • Příčiny: – Fyzikální – Chemické – Biologické
Nemoci z genetického hlediska • Nemoci monogenní • Nemoci multigenní – multifaktoriální
Multifaktoriální nemoci • Projevují se obyčejně v postreprodukčním věku – selekční tlak • Jsou projevem nerovnováhy genomu a zevního prostředí – civilizační nemoci
Multifaktoriální dědičnost
Efekt zkoumané alely • • Je alela riziková jen pro jednu chorobu, nebo pro více chorob? Je alela pro některou chorobu riziková a pro jinou se uplatňuje jako ochranný faktor?
Studium multifaktoriální dědičnosti
Asociační studie
Výběr vzorku pacientů a vzorku kontrol 1. 2. 3. 4. Severly affected x Extremely normal Affected with early onset x Normal eldery Positive family history x Negative family history Affected x Normal with intense environmetal exposure 5. Eldery survivor x Young I. Day (ed. ), Molecular Genetic Epidemiology – A Laboratory Perspective
Confoundings „matoucí faktory“ • Rozvrstvení populace • Linkage disekvilibrium mezi studovaným markrem a skutečnou nemoc způsobující alelou • Rozdíl v genetických a environmentálních rizikových faktorech mezi pacienty a kontrolami
Kauzální asociace • • • Konzistence asociace Síla asociace Biologická věrohodnost Biologický gradient Existence analogií Specificita – těžko očekávatelná u pleiotropních genů • Experimentální důkaz The Pharmacogenomics Journal (2002) 2, 349– 360
Metody detekce genových polymorfismů
Typ polymorfismu • SNP • Short repeats • Insertion/deletion
Metody detekce nukleotidových polymorfismů • Hledání přítomnosti neznámé alely • Detekce známých alel
Využívané metodiky • PCR • RFLP – ELFO na agaróze • Real time PCR • PAGE – SSCP, heteroduplexní analýza • Kapilární elektroforéza – v podstatě varianta PAGE
Strategie volby metody • • Flexibilita Cena Dostupnost Rychlost vyšetření
PCR 1983 Kary Mullis 1993 Nobelova cena
Amplifikace DNA
Základní komponenty reakce • • • voda pufr d. NTP (d. ATP+d. TTP+d. CTP+d. GTP) Mg. Cl 2 Taq polymeráza • primers • templát
Teplotní režim • • • 96ºC Iniciální denaturace 96ºC denaturace 40 -72ºC annealing 72ºC elongace 72ºC závěrečná elongace 4ºC zchlazení 30 x
Elektroforéza v agarovém gelu
Přímá sekvenace • Umožní detekovat dosud nepoznané mutace/polymorfismy • Drahá • Relativně zdlouhavá • Metody využívající sekvenační instrumentárium
PCR s následnou analýzou délky produktů • Pokud je polymorfismus způsoben insercí/delecí většího počtu bází, produkt PCR analyzujeme přímo na agarové elektroforéze. V případě analýzy počtu dinukleotidových repetic používáme kapilární elektroforézu. • Alelově specifické primery – poskytnou produkt jen za přítomnosti dané aley
PCR s následnou RFLP • Pokud polymorfismus způsobuje vznik restrikčního místa, podrobíme produkt PCR působení daného enzymu a na agarové elektroforéze pozorujeme výsledek. • Mismatch primery – umožňují vnést restrikční místo do blízkosti SNP a umožní jeho detekci pomocí endonukleáz
Real-time PCR • Různé systémy sond (Taq. Man, FRET) • Melting curve analysis
Metody využívající kapilární sekvenátor • SNPlex • SNa. Pshot
Microarrays and chips
High throughput techniques • Snaha zvýšit množství zpracovaného materiálu a získaných dat za kratší čas. • Větší nároky na přístrojové vybavení. • Větší nároky na bioinformatickou podporu při zpracování dat.
High throughput techniques • Arrays • SAGE • High-throughput sequencing
Co je microarray • Skleněná nebo plastová destička/membrána s maticí mikroskopických bodů, které obsahují DNA sondy
K čemu je microarray dobrá? • Technologie microarrays umožňuje analyzovat během jednoho experimentu až desetitisíce genů. • Přináší ohromnou časovou úsporu analyzovaného vzorku. • Umožňuje automatizovat proces analýzy DNA
Nevýhody DNA microarrays • Vyžadují obvykle nákladné přístrojové vybavení. • Samotné arrays jsou poměrně nákladné, ale při přepočtu na analýzu jednoho genu je tato zpravidla levnější než při použití klasických postupů. • Výsledky získané paralelním studiem několika tisíc genů vyžadují speciální postupy při statistickém zpracování.
Pracovní postup • „spotování“ arraye – specializovaná firma • Izolace analyzované DNA/RNA/c. DNA • Označení studované NA pomocí např. chemiluminiscenční značky. • Hybridizace s array. • Analýza v readeru • Statistické zpracování (clusterová analýza)
Praktické použití DNA arrays • Expression profiling • Genotyping, SNP detection • Comparative genomic hybridization
Podobné technologie • Agilent Technology, Lab-on-a-Chip
Tissue microarrays
- Slides: 72