Tcnicas utilizadas no estudo da expresso de genes

Técnicas utilizadas no estudo da expressão de genes Vera Andrade 2014

Como analisar uma molécula de DNA? Desde que o homem soube que a informação genética era codificada por nucleotídeos da molécula de DNA, ele quis olhar para a molécula e determinar a sequencia de nucleotídeos e descobrir como os genes funcionam Isto era quase impossível Avanços no conhecimento de enzimas e de tecnologias tornaram isto possível

Enzimas endonucleases de restrição Arber, Nathans e Smith isolaram a primeira enzima de restrição Mecanismo natural de defesa de algumas bactérias contra os vírus que as infectam Atuam em pontos específicos promovendo o corte do DNA viral Principais ferramentas da Engenharia Genética

Enzimas endonucleases de restrição As enzimas nucleases de restrição catalisam a hidrólise de uma ligação fosfodiéster em um ácido nucléico Cortam o DNA em sítios específicos determinados por uma curta sequência de nucleotídeos

Ligases Weiss e Richardson – isolou a enzima DNA ligase, enzima que une duas extremidades do DNA

Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas durante a aplicação de uma diferença de potencial Depois de cortar DNA em pequenos pedaços, foi preciso separar e analisar Joseph Sambrook (1973) – refinou a técnica de eletroforese de DNA usando agarose e brometo de etídio

Eletroforese Princípio do método Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre, deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável Para que uma partícula se mova é necessário que possua carga elétrica livre, isto é, excesso ou diferença de elétrons DNA carga negativa do (dada pelos oxigênios do grupamento fosfato) As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, as de menor massa migram mais rápido que as de maior massa

Eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida Assim, fragmentos de DNA obtidos da técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma voltagem Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao polo positivo Moléculas grandes migram lentamente, enquanto moléculas pequenas movem-se rapidamente

Aplicação da Técnica de Eletroforese em gel Teste de paternidade Perícia criminal Diagnósticos de doenças Identificação de polimorfismos Outros

Hibridização de Ácidos Nucléicos Uma vez que um gene foi isolado como um pedaço do DNA, queremos saber de qual cromossomo o gene é originado e onde está localizado no cromossomo, em quais células do organismo ele está sendo transcrito, verificar a existência de mutações

Hibridização de Ácidos Nucléicos Dupla fita de DNA ligadas por pontes de hidrogênio Pontes de hidrogênio podem ser quebradas elevando a temperatura até 90º C ou submetendo a p. H extremos Liberam as fitas entre si, mas não quebram as ligações covalentes que ligam os nucleotídeos dentro da fita Quando baixa a temperatura, as fitas voltam a formar hélices

Hibridização de DNA Uma sonda de DNA é um DNA curto de fita simples, marcado com substâncias radioativas ou quimioluminescentes – um oligonucleotídeo de 10 a 1. 000 nucleotídeos de comprimento 2 sondas diferentes permitem detectar sequências normais do gene e sequências

Southern blotting Detecção de fragmentos específicos de DNA pela transferência do gel (eletroforese) seguido da hibridização Podem detectar a suscetibilidade de indivíduos que herdaram genes anormais Exemplo – câncer de mama, gene BRCA 1

Southern blotting Peso Pilha de papel toalha Folha de nitrocelulose ou nylon Gel de agarose com os fragmentos de DNA Solução alcalina de hidróxido de sódio (NAOH) - promove a desnaturação da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas, que depois irão aderir à membrana e irá parear com a sonda de sequência conhecida e idêntica, ou então complementar,

Hibridização in situ no local Localiza sequências de ácidos nucléicos nas células e cromossomos Ácidos nucléicos e outras macromoléculas ocupam posições dentro da célula e tecidos e uma grande quantidade de informações pode ser perdida quando essas moléculas são extraídas da célula Por esta razão foram desenvolvidas técnicas que detectam ácidos nucléicos e macromoléculas dentro da célula ou em partes do cromossomo e também de RNA

Hibridização in situ no local

Hibridização in situ no local

Clonagem de DNA

Clonagem de DNA Fragmento de DNA podem ser cortados por enzimas de restrição Separados por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida O fragmento DNA pode ser determinado por hibridização DNA ligase, surgem durante a replicação e reparo do DNA, unem um fragmento de DNA para produzir uma molécula de DNA recombinante e sela novamente os cortes na estrutura do DNA

Clonagem Molecular

Plasmídeos bacterianos Plasmídeos são moléculas circulares duplas de DNA capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico Ocorrem geralmente em bactérias e em alguns organismos eucariontes unicelulares (Saccharomyces cerevisiae) e células de eucariontes superiores

Plasmídeos bacterianos Plasmídeo contem uma (3) origem de replicação (ori) que permite o vetor se replique dentro da célula independente do cromossomo Contem (2) sítio onde vai agir uma enzima de restrição, a fim que o plasmídeo seja aberto e o fragmento de DNA estranho seja inserido (1) Um gene com capacidade de construir resistência a antibiótico

Plasmídeos bacterianos Podem ser usados para clonar DNA Usados como vetores para transportar Clonar produzir cópias idênticas da molécula ou de um fragmento da molécula

Plasmídeos bacterianos

Plasmídeos bacterianos Produção de insulina por E. coli Produção de Fator VIII da coagulação Fator VIII – hemofilia, pessoas sofrem de episódios de sangramento sem controle e o tratamento padrão é injeção com fator VII concentrado, obtido de amostras de sangue, deixando as pessoas expostas ao risco de infecção com o HIV

Biblioteca São coleções de sequencias de DNA usadas para armazenar informação coleção de genes recombinantes

Biblioteca genômica É uma coleção de clones de DNA representando o genoma de um organismo

Biblioteca c-DNA Coleção de clones com insertos de DNA complementar (c. DNA) sintetizada a partir de moleculas de m. RNA de uma célula DNA é copiado do m. RNA produzido pela transcriptase reversa Proteína a sequência de aa sequência do DNA sonda de DNA hibridização gene livre de introns

Reação em Cadeia da Polimerase - PCR A Polymerase Chain Reaction (PCR) é uma reação termodinâmica enzimática cíclica de polimerização de DNA (amplificação de sequências específicas de DNA) na qual os produtos de um ciclo são substratos para o ciclo seguinte Tecnologia usada in vitro, sem o uso da célula

O que sabemos? in vivo in vitro A enzima helicase rompe as pontes de hidrogênio O calor rompe as pontes de hidrogênio A DNA polimerase promove a replicação do DNA Taq polimerase promove a replicação do DNA Vários ciclos de aumento e diminuição da temperatura promovem a replicação do DNA (amplificação do DNA)

Como funciona DNA com todos os genes Tampão de reação (p. H) d. NTP’s (nucleotídeos A C T G) Polimerase (Taq Polimerase) Mg. Cl 2 (íon usado pela Taq) Primers iniciadores

Quais são as aplicações da PCR? Aplicação Teste de Identificação de indivíduos Diagnóstico moleculares de genes envolvidos em doenças Identificação e isolamento de genes e nucleotídeos Polimorfismos genéticos

DNA chips STEPHEN P. A. FODOR Desenvolver um processo para gerar arranjos (arrays) de alta densidade, miniaturizados, contendo compostos biológicos Microarrays Isso levou ao desenvolvimento do primeiro chip de DNA e das técnicas necessárias para ler e analisar os resultados para estudos genômicos em larga escala O processo foi bastante refinado desde então e o sucesso desta tecnologia levou, em 1993, à criação de outra empresa, a Affymatrix Inc. Fodor é atualmente o CEO da Affymatrix

DNA chips Microarrays 1995 Stanford University -Pat Brown and Ron Davis Desenvolveram um método para preparar chips de DNA no laboratório, “spotando” fragmentos inteiros de DNA em uma lâmina de microscópio Também construíram um robô que utiliza tips para aplicar as gotinhas contendo DNA O sítioweb do laboratório em Stanford fornece instruções completas para a confecção de chips de DNA, tornando essa tecnologia acessível à comunidade científica