Tcnicas para el estudio de expresin de genes

Técnicas para el estudio de expresión de genes v Hibridación sustractiva v SAGE v ADNc – AFLP v DDRT – PCR v Arrays de ADN v. Tratamiento con bisulfito v Northern Blot v RPA v RT-PCR v Hibridación In Situ Estudio de la expresión global Epigenética Expresión de genes específicos

Arrays de ADN (Chips o Disposiciones de ADN)

Tipos de arrays v. Arrays de ADN • • Microarrays Gene-chip® Chips microelectrónicos Macroarrays v. Arrays de Tejidos

¿Qué es un array de ADN? Un array es un conjunto de sondas moleculares de composición conocida fijadas de manera ordenada sobre un soporte sólido. Estas sondas pueden ser clones de ADN, productos de PCR o bien oligonucleótidos sintéticos.

Microarray de ácidosde nucleicos Microdisposiciones ADN o Microarrays • Tecnología basada en capacidad de hibridación de los ácidos nucleicos PERO ENTONCES… ¿QUÉ DIFERENCIA EXISTE ENTRE UN MICROARRAY Y EL NORTHERN BLOT?

Hibridación Procedimiento experimental 1. La hélice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso físico (calor) o químico, rompe los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN. 2. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza. 3. Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples marcadas (sonda). 4. En la muestra combinada las moléculas sencillas se van uniendo por las zonas complementarias y se va formando una nueva molécula hibridada.

Microarray Northern Blot • Sonda fijada sobre un soporte • La muestra se marca y se agrega • Se fijan distintas sondas para varios genes. • Evalúa la expresión de varios genes en dos muestras a la misma vez. • Muestra fijada sobre un soporte • La sonda se marca y se agrega • Se utiliza una sonda para un gen. • Evalúa la expresión de un gen en una sola muestra.

Pasos seguir… Pasos aa seguir… ejemplo: comparación de expresión de RNA üAdquirir el soporte (“comprar”) üAislar RNA de células ó muestras de tejidos üConvertir RNA en c. DNA üUnir c. DNA con nucleótidos fluorescentes üHibridarlo con la matriz üDetectar y cuantificar fluorescencia utilizando un scanner laser üAnalizar los resultados

Impresión de Microarray Síntesis previa

Aislar el material que quiero estudiar… Extracción de RNAt o RNAm RNA A RNA B

RNA A RNA B RT con un nucleótido marcado con un colorante c. DNA A c. DNA B Hibridación con la matriz

Detector de fluorescencia

El detector envía TODOS los datos a una computadora

c. DNA B c. DNA A Ay. B La señal es proporcional a la cantidad de transcripto en la muestra original

Análisis de resultados SIEMPRE se normalizan los resultados de los genes analizados con genes “housekeeping” (es decir, aquel que no debería variar de una muestra a otra)

Ventajas y desventajas PROS • Permite analizar un gran número de genes al mismo tiempo en un sólo experimento • Se puede observar nivel de expresión • Permite comparaciones inter e intraespecies CONS • No es una medida cuantitativa • Se requiere conocimiento previo de la secuencia • Alto costo • Análisis muy riguroso y matemáticamente dificultoso

• El análisis de los perfiles de transcripción, no es suficiente para explicar los cambios funcionales observados en la célula. • Los resultados deben confirmarse con técnicas complementarias (Northern blot, Real Time-RT-PCR, Hidridación In Situ), lo que supone una labor adicional.

Otras aplicaciones del Microarray Ø Detección de mutaciones y polimorfismos Ø Secuenciación Ø Diagnóstico clínico Ø Screening y toxicología de fármacos • Farmacogenómica (asociación entre perfil genético y respuesta terapéuticas a drogas) • Toxicogenómica (evaluar cambios frente a sustancias tóxicas) Ø Seguimiento de terapia Ø Medicina preventiva Ø Hibridación comparativa del genoma Ø Inmunoprecipitación de la cromatina

Gene. Chip® • 50. 000 sondas • No se pueden procesar dos muestras a la vez

Gene. Chip® en el desarrollo de vacunas

Chips microelectrónicos o Nanochip®

Macroarrays EXTRACCIÓN DE ARNm a ADNc MARCACIÓN RADIOACTIVA DE ADNc HIBRIDACIÓN CON SONDAS FIJAS EN SOPORTE (NITROCELULOSA O NYLON) REVELADO VENTAJAS: MÁS BARATO, RESULTADO VISIBLE A SIMPLE VISTA DESVENTAJAS: UNA MUESTRA POR ARRAY, RADIOACTIVIDAD

Arrays de Tejidos o TMA Consiste en un bloque de parafina (soporte) que contiene hasta 1000 muestras de distintos tejidos tomadas de biopsias y dispuestas en forma ordenada y en una posición precisa.

Arrays de Tejidos o TMA

Técnicas para el estudio de expresión de genes v Hibridación Sustractiva v SAGE v ADNc – AFLP v DDRT – PCR v Arrays de ADN v. Tratamiento con bisulfito v Northern Blot v RPA v Real Time PCR v Hibridación In Situ Estudio de la expresión global Epigenética Expresión de genes específicos

Estudio de la metilación del ADN