TCNICAS IMUNOLGICAS UM TESTE SOROLGICO PODE SER QUALITATIVO

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS

UM TESTE SOROLÓGICO PODE SER QUALITATIVO, SEMI-QUANTITATIVO OU QUANTITATIVO. . . • Qualitativo: + ou – • Semi-quantitativo: amostra testada foi diluída – a maior diluição que apresentar reação é o seu título (ex. + ate a diluição 1: 320) • Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado. IMPORTANTE : Finalidade do teste 1. Triagem 2. Diagnóstico ?

Alguns fatores que afetam as medições das reações Ag/Ac • • Afinidade Avidez Taxas Ag-Ac Reações Cruzadas Anticorpos: • Monoclonais • Policlonais

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS • Técnicas sem uso de marcadores – Reações de Precipitação – Reações de Aglutinação • Técnicas com uso de marcadores – – ELISA Citometria de fluxo Imunofluorescência Radioimunoensaio

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS • PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese • AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação - Teste de Coombs • IMUNOENSAIOS - Radioimunoensaio - ELISA - Imunofluorescência - Citometria de Fluxo PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DE IMUNODIAGNÓSTICO

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO ZONA DE EQUIVALÊNCIA EFEITO PRÓ - ZONA EFEITO PÓS - ZONA

IMUNODIFUSÃO DUPLA ØUtiliza uma matriz de ágar Ø Ag + Ac = linha de precipitação visível Possui baixa sensibilidade ; demorado (18 -24 hrs)

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina: • Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo: Ac • • As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante Ag Ag Ac Utilização da técnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imunes

IMUNODIFUSÃO RADIAL • Método de Mancini – Anticorpo no gel Ac no gel Ag – Antígeno no poço –Vice-versa Ag Ag – Diâmetro do anel é proporcional à concentração do Ag Diameter 2 • Interpretação Ag Concentração Ag

IMUNODIFUSÃO RADIAL ØFácil, baixo custo ØUtiliza uma matriz de ágar ØÉ quantitativa Utilização: dosagem de Ig. G, Ig. A e Ig. M e proteínas séricas

IMUNOELETROFORESE • • • Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação. É qualitativo Utiliza lâminas recobertas com ágar 2 na coluna 2 -Anti-soro na canaleta 1 - Separação de antígenos Ag + canaleta Ag 3 - Difusão e precipitação Útil para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma múltiplo e a macroglobulinemia

IMUNOELETROFORESE

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO • Pode ser direta ou indireta • + sensíveis qtidade de Ac 500 vezes menor partículas amplificam a reação • Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semiquantitativo) Agregação visível de partículas USO: ØTipagem ABO ØTestes confirmatórios para sífilis, FR Eritrócitos Bactérias Fungos látex

AGLUTINAÇÃO DIRETA Partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais na superfície + Ac = Aglutinação Hemácias Bactérias Protozoários Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) 1) Amostra de sangue na placa teste: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 3) Controle negativo: 4) Mistura-se:

AGLUTINAÇÃO DIRETA 5) Leitura do resultado: Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na negativo positivo placa teste);

AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA) Ags solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: • As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. • O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. • Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglut + Aglut -

AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: FATOR REUMATÓIDE • Fator Reumatóide: Anticorpos que reconhecem epítopos presentes na fração cristalizável (Fc) da molécula de Ig. G. A maioria destes Acs são da classe Ig. M porém pode-se encontrar também Acs Ig. A e Ig. G. • Teste: Visualização de aglutinação das partículas de látex revestidas pelo antígeno (no caso Ig. G humana ou de coelho) • Interpretação: No caso de artrite reumatóide surge uma alta quantidade de FR de alta afinidade Enfermidades em que o encontro de FR é comum Causas virais HBV, HCV, Mononucleose, influenza, AIDS, pós vacinação Doenças autoimunes Artrite Reumatóide, Lúpus Eritematoseo sistêmico, Esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjörgren, cirrose biliar, hepatite auto-imune, etc Neoplasias Após irradiação ou quimioterapia Infecções bacterianas Tuberculose, sífilis, hanseníase, salmonelose, endocardite bacteriana subaguda, brucelose, borreliose Doenças parasitárias Malária, esquistossomose, filariose, tripanossomíase

TESTE DE COOMBS (Antiglobulina) • DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrócitos • INDIRETO: Detecta Ac anti-eritrócitos no soro 1. Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (mãe produz Ig. Ganti. Rh). 2. R. medicamentosa 3. R. transfusional

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com antígeno solúvel. Resultado negativo: (ausência de h. CG na urina): ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-h. CG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de h. CG. Resultado positivo: (presença de h. CG na urina): não ocorre aglutinação.

IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Princípio da técnica: • Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiações UV, emite luz no espectro visível. • A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um microscópio de fluorescência • Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). IFA direta: • Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele. IFA indireta: • pesquisa de antígenos ( plasmódio em hemácia) e de anticorpos ( sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, doença de chagas, malária, etc)

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Treponema pallidum Tripanosoma cruzi Pneumocystis carinii Giardia lamblia

CITOMETRIA DE FLUXO ( célula medida em movimento ) • Separação de células marcadas por fluorescência; • Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) • Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. • É um teste qualitativo e quantitativo. • Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser. CD 18 CD 4 CD 125 CD 147

CITÔMETRO DE FLUXO • SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO • SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. • SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

CD 4 CD 8 CD 20

USO Ø Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas Ø Isolar populações celulares ØQuantidade, tamanho, granulosidade; Ø Distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ags Ø Tamanho celular.

APLICAÇÕES CLÍNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO - Análise da subpopulação linfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Análise de reticulócitos - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Quantificação de células progenitoras (Stem cells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA • O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. • O produto final ação da enzima sobre o substrato = COR • Produto final corado leitura em fotocolorímetro. Direto = Ag • Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo. Õ Õ Indireto = Ac Vantagens do ELISA: -Utiliza reagentes estáveis -Teste de alta sensibilidade -Seguros e de baixo custo -Não trabalha com radioisótopos -pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação -Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc.

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA Ac marcados com Enzimas + Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase INDIRETO Ag + substrato = COR ü Qualitativos ü Quantitativos DIRETO OU SANDUÍCHE

Ponte de corte (“ cut-off”) : é o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo

ESTE EXEMPLO É DE ELISA DIRETO OU INDIRETO?

CURVA PADRÃO - ELISA

RADIOIMUNOENSAIO - RIA Moléculas marcadas com isótopo ( I 125 , I 131 ) Ø Marcações: l I 125: emite raios gama l H 3: raios beta Ø Desvantagem manipulação de isótopo radioativo. Ø

RADIOIMUNOENSAIO

RADIOIMUNOENSAIO • Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc. • Vantagens: – Alta sensibilidade – Permite medidas rápidas e precisas – Limiar de detecção em nanogramas e picogramas. • Desvantagens: – Custo – Vida média dos reagentes – Risco operacional (radiação)