Szkoa Letnia STC d 2011 PODSTAWOWE INFORMACJE Z

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 PODSTAWOWE INFORMACJE Z ZAKRESU BIOFILMU dr inż. Joanna Biernasiak dr inż. Ilona Błaszczyk

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Leeuwenhoek A. V. (1684). Some microscopical observations about animals in the scurf of the teeth. Phil Trans, 14, 568 -574 W publikacji przedstawiono pierwsze wyniki badań, świadczące iż mikroorganizmy mogą adherować do powierzchni zębów i formować osiadłe struktury. Angst E. C. (1923). The fouling of ships bottoms by bacteria. Report, bureau construction and repair. Washington, DC: United State Navy Department 2 W publikacji podkreślono, iż bakterie morskie wykazują większą tendencję do przylegania do kadłubów statków, niż do występowania w wodzie w formie planktonicznej.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Kunicki – Goldfinger W. J. H. 1968. Życie bakterii. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa Ziemińska S. 1980. Mikrobiologia wody i ścieków. [W] Dobrzański W. T. (red. ): Zarys mikrobiologii dla farmaceutów. Wydanie drugie. Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa W wymienionych pozycjach naukowych zwrócono uwagę, iż w warunkach naturalnych, bakterie nie tworzą kolonii, a rosną często w tzw. zooglejach, czyli skupieniach wydalanego przez siebie śluzu.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Biofilmy to złożone, wielokomórkowe struktury drobnoustrojów, otoczone warstwą śluzu, wykazujące adhezję do powierzchni biologicznych i abiotycznych. Shi X. & Zhu X. (2009). Biofilm formation and food safety in food industries. Trends in Food Science & Technology, 20, 407 -413

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Struktura biofilmu: Rysunek 1. Zróżnicowanie aktywności metabolicznej w obrębie biofilmu [http: //bioinfo. mol. uj. edu. pl/articles/Buchala 05]

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Etapy tworzenia biofilmu: 1. Adhezja odwracalna pojedynczych komórek do powierzchni; 2. Adhezja nieodwracalna komórek; 3. Tworzenie mikrokolonii; 4. Różnicowanie się osiadłej populacji bakterii i utworzenie dojrzałej formy biofilmu; 5. Migracja komórek.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 1. Adhezja odwracalna ü Fizyczne oddziaływania, tj. siły hydro i termodynamiczne, dyfuzja, grawitacja, siły Van der Waalsa, elektrostatyczny ładunek powierzchni, ruchliwość samych komórek Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [http: //biology. binghamton. edu/davies/research. htm]

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 2. Adhezja nieodwracalna ü Chemiczne intereakcje, tj. wiązania wodorowe oraz par i kompleksów jonowych ü Synteza i wydzielanie zewnątrzkomórkowych (EPS – extracellular polymeric substances) Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [http: //biology. binghamton. edu/davies/research. htm] tworzenie biopolimerów

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 3. Tworzenie mikrokolonii ü Indukcja i supresja poszczególnych genów ü Ekspresja odpowiednich cech genotypowych ü Wzmożona synteza i wydzielanie EPS Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [http: //biology. binghamton. edu/davies/research. htm]

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 4. Dojrzewanie biofilmu ü Intensywne namnażanie się komórek, ü Wytwarzanie glikokaliksu, ü Adsorbcja substancji mineralnych, związków organicznych oraz komórek innych drobnoustrojów do struktury glikokaliksu. Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [http: //biology. binghamton. edu/davies/research. htm]

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 5. Migracja komórek ü Osiągnięcie przez błonę biologiczną, tzw. krytycznej grubości ü Migracja komórek z peryferycznych części dojrzałego biofilmu do otaczającego środowiska ü Proces kolonizacji nowych miejsc/płaszczyzn Rys. 2. Formowanie biofilmu na powierzchniach stałych w warunkach statycznych [http: //biology. binghamton. edu/davies/research. htm]

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Czynniki warunkujące tworzenie biofilmów: 1. Wydzielanie przez drobnoustroje zewnątrzkomórkowych 2. biopolimerów (EPS – extracellular polymeric substances); 2. Hydrofobowość/hydrofilowość płaszczyzn i komórek; 3. Rodzaj i charakter powierzchni; 4. Czynniki środowiskowe; 5. Obecność innych mikroorganizmów.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 1. Największy wpływ na powstawanie biofilmów mają wydzielane przez komórkę zewnątrzkomórkowe biopolimery (EPS), które obejmują różne klasy makromolekuł, takie jak: białka, polisacharydy, kwasy nukleinowe czy fosfolipidy. 2. Syntezie zewnątrzkomórkowych biopolimerów sprzyja spowolniony wzrost drobnoustrojów, nadmiar substratu z dostępnym źródłem węgla przy jednoczesnym niedoborze azotu, potasu i fosforanów. 3. W procesach adhezji mikroorganizmów do powierzchni abiotycznych największą rolę odgrywają białka i polisacharydy.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Polisacharydy: ü akumulacja na powierzchni komórki w postaci śluzu lub wydzielanie do podłoża ü wypełnianie pustych mikroorganizmów przestrzeni między komórkami ü zabezpieczanie komórek przed destrukcyjnym działaniem osmotycznych Białka: i oksydatywnych czynników, w tym środków dezynfekcyjnych ü uwolnienie do roztworu – utworzenie warstwy kondycjonującej ü wzrost koncentracji białek – I etap adhezji ü sekrecja białek in situ – nasilenie adhezji i stabilne „zakotwiczenie” komórek do powierzchni docelowej ü adsorbcja na powierzchni związków toksycznych i zapobieganie

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Biofilmy – zagrożenie w wielu gałęziach gospodarki 1. Praktyka medyczna ü Zakażenia u pacjentów adhezja drobnoustrojów do przyrządów i materiałów syntetycznych tj. cewników, drenów, protez stawowych, soczewek kontaktowych i zespoleń naczyniowych ü Rozprzestrzenianie się chorób zakaźnych adhezja bakterii chorobotwórczych do powierzchni stałych ü Próchnica i paradontoza adhezja drobnoustrojów do powierzchni zębów

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 2. Przemysł spożywczy ü Tematyka związana z tworzeniem i skutkami obecności biofilmów została najlepiej udokumentowana w branży mleczarskiej i mięsnej. ü Pojedyncze komórki Listeria monocytogenes, Bacillus cereus czy Streptococcus thermophilus występują na powierzchniach stykających się z mlekiem surowym czy surowcem mięsnym 50050 tys. razy rzadziej niż błony biologiczne tych bakterii ü Z wyników badań jasno wynika, że biofilm może stanowić realne zagrożenie dla jakości, w tym bezpieczeństwa produktów finalnych, ponieważ błony biologiczne mogą być bezpośrednią przyczyną występowania w żywności toksyn drobnoustrojowych.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Drobnoustroje, które wykazują przyczepność do powierzchni są bardziej oporne na działanie środków dezynfekcyjnych, co ma bardzo istotne znaczenie dla utrzymania higieny i przyczynia się do nieefektywności procesów mycia i dezynfekcji Kinetyka dyfuzji związków przeciwdrobnoustrojowych, o względnej masie cząsteczkowej wynoszącej około 100 k. Da, przez warstwy dojrzałego biofilmu może osiągnąć wartość niższą nawet o 60 -80% w porównaniu z dyfuzją tych substancji przez agregaty komórek zawieszonych w płynie hodowlanym.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Oporność biofilmu na czynniki antymikrobiologiczne: 1. Wytwarzanie ochronnej warstwy śluzu; 2. Zmniejszenie aktywności metabolicznej; 3. Zmiany zachodzące na poziomie molekularnym; 4. Procesy chemicznego komunikowania; 5. Zespoły związków białkowych.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Gibson i wsp. (1999) badali oporność biofilmu na środki odkażające tj. Easyclean i Ambersan stosowane do higienizacji instalacji przemysłu spożywczego. Wykazano, że testowane środki były nieskuteczne w odniesieniu do biofilmu utworzonego przez Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus. Liczba bakterii na powierzchni ze stali nierdzewnej zmniejszyła się o jeden rząd wielkości. Gibson H. , Taylor J. H. , Hall K. E. . & Holah J. T. (1999). Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. Journal of Applied Microbiology, 87 (1), 41 -48

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 W badaniach prowadzonych przez Wirtanen i wsp. (1996) wykazano, że potraktowanie 3 -dniowego biofilmu utworzonego przez bakterie z rodzaju Bacillus przegrzaną parą (125°C, 30 min. ) nie wpłynęło na pełną inaktywację komórek. Wirtanen G. , Husmark U. & Matilla-Sandholm T. (1996). Microbial evaluation of the biotransfer potential from surfaces with Bacillus biofilms after rinsing and cleaning procedures in closed foodprocessing system. Journal of Food Protection, 59 (7), 727 -733

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Biofilmy w przemyśle cukrowniczym: ü W literaturze światowej brak jest informacji na temat biofilmów w przemyśle cukrowniczym ü Dane literaturowe dotyczą głównie oceny mikrobiologicznej końcowego produktu produkcji i pracowników oraz oceny higieny środowiska

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 1. Technologiczny proces otrzymywania cukru z buraków cukrowych, można rozpatrywać jako system ekologicznych warunków odpowiednich dla rozwoju licznej mezofilnej i termofilnej mikroflory. 2. Ilość i rodzaj drobnoustrojów towarzyszących temu procesowi jest funkcją jakości mikrobiologicznej surowca oraz warunków fizycznych i chemicznych w środowisku produkcyjnym.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 3. Ogólna liczba drobnoustrojów zanieczyszczających buraki cukrowe wynosi 105 - 108 jtk/g, przy czym dominują bakterie z rodzaju Clostridium, Bacillus, Micrococcus i Flavobacterium. naturalnym Przy mikroflorę intensywnym zanieczyszczającą nawożeniu stanowią również oportunistyczne bakterie pochodzenia jelitowego oraz bakterie chorobotwórcze, np. Listeria monocytogenes i patogenne szczepy Esherichia coli. Kręgiel D. , Piątkiewicz A. , Żakowska Z. , Kunicka-Styczyńska A. (2008). Zanieczyszczenia mikrobiologiczne surowców. W: Mikrobiologia techniczna

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 4. Przy krojeniu buraków następuje przejście mikroorganizmów z powierzchni zewnętrznej na całą powierzchnię krajanki. Liczba drobnoustrojów w 1 g krajanki wynosi 104 - 1010 jtk bakterii mezofilnych i od 102 - 104 jtk bakterii termofilnych. 5. Kolejnym etapem otrzymywania cukru z buraka cukrowego jest ekstrakcja krajanki gorącą wodą, w celu otrzymania soku surowego. W czasie przemieszczania mas często powstają w ekstraktorze przestrzenie (biofilmy ? ? ? ) gdzie zalega krajanka tworząc dogodne warunki dla rozwoju drobnoustrojów mezofilnych. Kowalska M. (2002). System HACCP a zagrożenia mikrobiologiczne w przemyśle cukrowniczym. Gazeta Cukrownicza, 6, 169 -173

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 6. Temperaturę dyfuzji przeżywają przetrwalniki niektórych bakterii mezofilnych m. in. tlenowe Bacillus megatherium, B. mycoides, B. mesentericus, B. macerans, B. polimyxa, B. cereus, B. subtilis i termofilne Geobacillus stearothermophilus oraz beztlenowe z rodzaju Clostridium. Temperatura panująca w aparacie dyfuzyjnym nie niszczy nieprzetrwalnikujących bakterii z rodzaju Leuconostoc wytwarzających pozakomórkowo dekstrany. Dobrzycki, J. (1988). Colloids and their role in sugar production. In J. Dobrzycki (Eds. ), The chemical bases of sugar technology. Warsaw: Technical and Scientific Publisher, pp. 73 -84.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 7. Ze względu na warunki panujące w kolejnych etapach procesu technologicznego, tj. wysoką temperaturę (>75ºC), wysokie p. H (>10, 0) i dużą zawartość suchej substancji (Bx>70º) cukier opuszczający wirówkę powinien być wolny od komórek wegetatywnych i mogą występować jedynie przetrwalniki bakterii i spory pleśni. W praktyce liczba drobnoustrojów w cukrze rośnie na kolejnych etapach suszenia i pakowania. Dominującą grupę drobnoustrojów w cukrze pobranym do badań w różnych miejscach produktowni (od wirówki cukrzycy I do pakowni) stanowią bakterie mezofilne. Kowalska M. (2002). System HACCP a zagrożenia mikrobiologiczne w przemyśle cukrowniczym. Gazeta Cukrownicza, 6, 169 -173

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Dotychczas nie opublikowano wyników badań wiążących zanieczyszczenie mikrobiologiczne cukru z biofilmem tworzonym na powierzchniach produkcyjnych. Przesłanką do potwierdzenia tej hipotezy są wyniki przeprowadzonych badań (Żakowska i Kunicka, 2002) wskazujące na powszechność zasiedlania stref martwych wirówek, taśm transporterów cukru suchego czy wagopakowaczek bakteriami i pleśniami mezofilnymi. Żakowska Z. , Kunicka A. (2002). Zagrożenia mikrobiologiczne. Czynniki wpływające na jakość cukru w procesie technologicznym. Nowe Cukrownictwo, 3,

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Tworzenie biofilmu w procesie produkcji cukru może być również rozpatrywane w aspekcie właściwości fizykochemicznych cukru białego. Jednym z ważnych kryteriów wymaganych przez producentów napojów bezalkoholowych jest zdolność cukru do tworzenia w zakwaszonych roztworach wodnych koloidalnych cząstek widocznych gołym okiem określanych w cukrownictwie jako kłaczki. Foong K. K. , Amal R. , Doherty W. O. S. & Edye L. A. (2002). A review on acid beverage floc. Zuckerindustrie, 127 (5),

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 W roztworach buraczanego cukru białego z procesem powstawania kłaczków wiąże się obecność saponiny. Saponina stanowi mniej niż 20% ogólnego składu chemicznego kłaczków. Inne substancje takie jak polisacharydy, białka, lipidy, pektyny, barwniki i koloidy obecne w roztworze mogą przyłączać się do wytrąconej saponiny i w ten sposób zwiększać makroskopowy efekt zjawiska. Poel P. W. van der, Schiweck H. , Schwartz T. (1998). Sugar Technology. Beet and Cane Sugar Manufacture. Berlin: 16. Verlag Dr. Albert Bartens

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 Biorąc pod uwagę doniesienia literaturowe dotyczące składu chemicznego kłaczków, nie można jednoznacznie przyjąć, że źródłem pochodzenia jego składników jest tylko surowiec, tj. , buraki cukrowe. Wydaje się uzasadnione podjęcie badań zmierzających do pełnej charakterystyki chemicznej matrycy biofilmu w aspekcie podatności cukru białego na tworzenie widocznych cząstek w roztworach określanych w cukrownictwie jako kłaczki.

Szkoła Letnia STC - Łódź 2011 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ