Szczepionki zawierajce rekombinantowe antygeny biakowe Szczepionki zawierajce rekombinantowe

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka szczepionek Ø Ściśle zdefiniowany skład Ø Bezpieczeństwo produkcji • • wyeliminowanie konieczności hodowli mikroorganizmów chorobotwórczych w celu izolacji antygenów szczepionkowych mikroorganizmy stosowane do produkcji antygenów rekombinantowych o statusie GRAS (Generally Recognized as Safe) Ø Bezpieczeństwo stosowania • • brak możliwości wywołania choroby niska odczynowość Ø Wymagają stosowania adiuwantów Ø Koszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu produkcji

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Ø Bakterie • • • dobrze scharakteryzowane łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych wydajne systemy ekspresyjne brak modyfikacji posttranslacyjnych możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych • możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające rozpuszczalność, zwiększające immunogenność

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Ø Drożdże • • dobrze scharakteryzowane łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych wydajne systemy ekspresyjne trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z genomem gospodarza • modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków disiarczkowych, glikozylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych • możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające immunogenność

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Ø Komórki owadzie • systemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub bakulowirusie • modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż w komórkach ssaczych • wrażliwe na zakażenia wirusowe Ø Komórki ssacze • modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja, fosforylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych, tworzenie mostków disiarczkowych • droga hodowla • stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do otrzymania

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Ø Rośliny transgeniczne • • • manipulacje genetyczne trudne do przeprowadzenia tania produkcja modyfikacje posttranslacyjne szczepienie drogą pokarmową wywołanie odporności błon śluzowych

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Czynnik etiologiczny – wirus HBV Ø Rodzina: Hepadnaviridae Ø Rodzaj: Orthohepadnavirus Ø Struktura: ikosaedralny nukleokapsyd otoczony podwójną osłonką; kulisty; śr. 42 nm Ø Kwas nukleinowy: DNA Ø Replikacja: hepatocyty Ø Rezerwuar: człowiek

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Ø Droga przenoszenia: krew i płyny ustrojowe, w tym wydzielina szyjki macicy, nasienie Ø Wysoka zakaźność – nawet 0, 1 μl krwi może spowodować zakażenie Ø Hodowla w warunkach laboratoryjnych – nie zakaża zarodków kurzych i powszechnie stosowanych linii komórkowych We krwi do 1010 wirusów/ml

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu B Ø Ø Ø Okres wylęgania 2 – 3 miesiące Początkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączka Żółtaczka Wyzdrowienie (90%) Antygenemia brak uszkodzenia wątroby Przewlekłe zakażenie (10%) Przetrwałe zapalenie wątroby Nadostre zapalenie wątroby (0, 1%) Aktywne zapalenie wątroby niewielkie uszkodzenie wątroby Marskość wątroby Pierwotny rak wątroby Zgon

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Wirusowe zapalenie wątroby typu B zakażenie okołoporodowe Ø Dzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw B v zakażenie z ostrymi objawami choroby Ø Dzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw B v v v zakażenie bez ostrych objawów choroby nosicielstwo HBV śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców, 15% dziewczynek) Na świecie 200 mln nosicieli HBV z tego 75% ulega zakażeniu podczas porodu

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Antygeny wirusa HBV Ø HBc. Ag – białko rdzenia Ø HBe. Ag – białko rdzenia Ø HBs. Ag – białko powierzchniowe • • tworzy zewnętrzną osłonkę wirusa nadmiar białka obecny we krwi w postaci kulistych lub pałeczkowatych agregatów

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Gen kodujący antygen HBs. Ag – koduje 3 polipeptydy Ø pre. S 1 Ø pre. S 2 ØS

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Odpowiedź immunologiczna na zakażenie HBV Ø Odpowiedź humoralna • • • przeciwciała anty-HBs. Ag (pre. S 1, pre. S 2 i S) przeciwciała anty-HBc. Ag przeciwciała anty-HBe. Ag Ø Odpowiedź komórkowa • limfocyty Tc

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki I generacji (plazmatyczne) Ø Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBs. Ag • • • białko S śladowe ilości białka pre. S 1 śladowe ilości białka pre. S 2 Ø Sposób otrzymywania – izolacja ciał kulistych i pałeczkowatych z krwi bezobjawowych nosicieli HBV, inaktywacja formaldehydem Ø Bezpieczeństwo – ryzyko transmisji patogenów przenoszonych przez krew Nie są stosowane w Polsce

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Pierwsza szczepionka zarejestrowana w 1986 r. Ø Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBs. Ag • białko S Ø Sposób otrzymywania – produkcja białka S w komórkach drożdży S. cerevisiae

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Pierwszy układ ekspresyjny opublikowany w 1982 r. (P. Valenzuela, A. Medina, W. J. Rutter, Nature, 289, 347 – 350) Ø wektor ekspresyjny – p. HBS-16 • • • autonomiczna replikacja ori replikacji p. BR 322 gen oporności na ampicylinę ori replikacji plamidu 2μ gen trp 1 sekwencja kodująca białko S pod kontrolą promotora ADH I dehydrogenazy alkoholowej I

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Ø gospodarz – S. cerevisiae XV 610 -8 C • szczep auksotroficzny – brak zdolności do wzrostu na podłożu nie zawierającym tryptofanu Ø białko S produkowane w postaci kulistych agregatów (agregaty 1000 x bardziej immunogenne niż pojedyncze cząsteczki białka S) Ø 2 – 5 μg białka z 200 ml hodowli

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Ø Ø Ø Adiuwant – wodorotlenek glinu Postać szczepionki – płynna Temperatura przechowywania – 2 -8°C Sposób podawania – domięśniowo Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6 tyg. ; 3 – po 6 m-cach od pierwszego szczepienia) Ø Skuteczność szczepionki • • • u 95% szczepionych ochronny poziom przeciwciał po 3 dawkach u 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniem 95% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed zakażeniem 98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed zakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzenia indukuje powstanie trwałej pamięci immunologicznej

Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał w cyklu szczepień przeciwko WZW typu B

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Ø Bezpieczeństwo szczepionki – wysokie • • • może być stosowana u kobiet ciężarnych matek karmiących piersią osób z niedoborami odporności Ø Niepożądane odczyny poszczepienne • • łagodne miejscowe odczyny poszczepienne rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych, wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony układu nerwowego Ø Przeciwwskazania do szczepień • • nadwrażliwość na składniki szczepionki ciężkie choroby przebiegające z wysoką gorączką

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Ø Skuteczne w szczepieniu poekspozycyjnym – uodpornienie czynnobierne (4 dawki – 0, 1, 2, 12 m-cy; HBIg równocześnie z pierwszą dawką szczepionki) Ø Dostępne w postaci szczepionek monowalentnych • • Engerix B, Glaxo. Smith. Kline H-B-VAX, Merck Sharp Dohme Ø Dostępne w postaci szczepionek skojarzonych • • • Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib, WZW B) Ambirix, Glaxo. Smith. Kline (WZW A, WZW B) Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki II generacji (rekombinowane) Ø Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Hansenula polymorpha (Hepavax Gene, Green Cross Vaccine, Korea) Ø Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Pichia pastoris

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B Szczepionki III generacji (rekombinowane) Ø Białka S i pre. S 2 produkowane w linii komórkowej CHO (Chinese Hamster Ovary cells), Heprecombe, Swiss Serum and Vaccine Institute

Saccharomyces cerevisiae Ø Ø Niski poziom produkcji i sekrecji białek Niestabilność plazmidów rekombinantowych Hiperglikozylacja białek Wąski zakres metabolizowanych źródeł węgla

Pichia pastoris i Hansenula polymorpha - podstawowa charakterystyka biochemiczna Źródła węgla i energii Źródła azotu Optymalna temperatura wzrostu P. pastoris H. polymorpha glukoza glicerol metanol jony amonowe sole kwasu azotowego (V) 37 -43 °C 30 °C

Metabolizm metanolu 1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 dehydrogenaza formaldehydowa, 5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, 7 - aldolaza fruktozo-1, 6 -bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo- 1, 6 -bisfosforanu

Drożdżowe systemy ekspresyjne Ø Ø • • • Szczepy gospodarzy ekspresyjnych Wektory ekspresyjne bakteryjne ori replikacji bakteryjny marker selekcyjny sekwencja umożliwiająca utrzymanie się wektora w komórce drożdży drożdżowy marker selekcyjny drożdżowy promotor i terminator transkrypcji Amp. R PTEF 1 Col. E 1 ori Drożdżowy wektor ekspresyjny URA 3 PHO 5 t 25 S r. DNA

Szczepy ekspresyjne Pichia pastoris Szczep Fenotyp Uwagi X-33, Y-11430 szczep dziki Selekcja antybiotykowa GS 115 His-, Mut+ Selekcja na podłożu bez histydyny; szybki metabolizm metanolu KM 71 His-, Muts Selekcja na podłożu bez histydyny; wolny metabolizm metanolu SMD 1168 His-, Pep 4 -, Mut+ Selekcja na podłożu bez histydyny; brak aktywności proteazy A; szybki metabolizm metanolu JC 300 Ade-, Arg-, His- Selekcja na podłożu bez adeniny, argininy i histydyny JC 308 Ade-, Arg-, His-, Ura- Selekcja na podłożu bez adeniny, uracylu, histydyny i argininy

Szczepy ekspresyjne Hansenula polymorpha Szczep Fenotyp Uwagi DL-1, NCYC 495, CBS 4732 szczep dziki Selekcja antybiotykowa DL 10 Leu-, Ura- Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu u. DLB 11 Leu-, Ura-, Pep 4 - Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu; brak aktywności proteazy A L 1 Leu- Selekcja na podłożu bez leucyny A 11 Ade- Selekcja na podłożu bez adeniny LR 9 Ura- Selekcja na podłożu bez uracylu

Promotory transkrypcji P. pastoris Promotor Uwagi AOX 1 (genu oksydazy alkoholowej) Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy i glicerolu FLD 1 (genu dehydrogenazy formaldehydowej) Indukowany metanolem i metyloaminą; represja w obecności glukozy i glicerolu PEX 8 (genu kodującego białko tworzące matrix peroksysomów) Słaba aktywność w obecności glukozy; wzrost aktywności w obecności metanolu GAP (genu dehydrogenazy aldehydu 3 -fosfoglicerynowego) Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i glicerolu YPT 1 (genu GTPazy niezbędnej w sekrecji białek) Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i metanolu

Promotory transkrypcji H. polymorpha Promotor Uwagi MOX (genu oksydazy metanolowej) Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności glicerolu DHAS (genu syntazy dihydroksyacetonu) Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności glicerolu FMD (genu dehydrogenazy mrówczanowej) Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności glicerolu AMO (genu oksydazy aminowej) Indukowany metylo- i etyloaminą; represja w obecności jonów amonowych YNT 1, YNI 1, YNR 1 (genów kodujących białka niezbędne w metabolizmie azotanów) Indukowane solami kwasu azotowego (V), represja w obecności jonów amonowych GAP (genu dehydrogenazy aldehydu 3 -fosfoglicerynowego) Konstytutywny PMA 1 (genu ATPazy błony cytoplazmatycznej) Konstytutywny

Drożdżowe markery selekcyjne P. pastoris Ø geny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynę Ø markery auksotroficzne • gen HIS 4 P. pastoris lub S. cerevisiae gen ARG 4 S. cerevisiae gen URA 3 P. pastoris gen ADE 1 P. pastoris • • •

Drożdżowe markery selekcyjne H. polymorpha Ø geny oporności na antybiotyki • • gen oporności na zeocynę gen oporności na fleomycynę Ø markery auksotroficzne • gen LEU 1. 1 H. polymorpha gen URA 3 H. polymorpha gen ADE 11 H. polymorpha gen LEU 2 S. cerevisiae gen URA 3 S. cerevisiae gen LEU 2 C. albicans • • •

Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży P. pastoris Ø Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną z genomem drożdży • 5’ fragment promotora AOX 1 5’ fragment promotora GAP gen HIS 4 P. pastoris • •

Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdży H. polymorpha Ø Sekwencje umożliwiające rekombinację homologiczną wektora z genomem drożdży • gen MOX H. polymorpha gen AMO H. polymorpha gen LEU 2 S. cerevisiae gen URA 3 S. cerevisiae • • • Ø Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdży • sekwencje ARS H. polymorpha

Zewnątrzkomórkowa produkcja białek Sekwencje sygnalne Ø obcego białka Ø α-faktora S. cerevisiae Ø kwaśnej fosfatazy

Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez komórki drożdży Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych genów kodujących białka opiekuńcze obecne w retikulum endoplazmatycznym Ø • • Foldazy izomerazy disulfidowe Białka opiekuńcze kalneksyna kalretikulina

Kierowanie białek do peroksysomów Peroksysomy Ø Ø • • • Zdolne do akumulacji dużej ilości białek Nie zawierają enzymów modyfikujących białka fosfokinaz glikozylaz proteaz Umożliwiają produkcję niezmodyfikowanych białek Sekwencja kierująca do peroksysomów -Ser-Lys-Leu-COOH peroksysomy H. polymorpha rosnąca w pożywce z metanolem

Szczepionki przeciwko wirusowi HPV (wirusowi ludzkiego brodawczaka) Ø Silgard (MSD) Substancja czynna – białko L 1 czterech typów HPV (16, 18, 6 i 11) Adiuwant – sole glinu Ø Cervarix (Glaxo. Smith. Cline) Substancja czynna – białko L 1 dwóch typów HPV (16 i 18) Adiuwant – sole glinu + MPL (monofosforylowany lipid A) Białko L 1 produkowane w drożdżach S. cerevisiae