Szabadgykk vizsglati lehetsgei a klinikumban Dr Kocsis Ibolya

Szabadgyökök vizsgálati lehetőségei a klinikumban Dr. Kocsis Ibolya Ph. D Semmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet Központi Laboratórium E-mail: kocsis@bel 1. sote. hu

OXIDATÍV STRESS JELENLÉTE ÉS SZEREPE KÜLÖNBÖZŐ BETEGSÉGEKBEN • • • diabetes mellitus és szövődményei cardiovasculáris megbetegedések rheumatoid arthritis daganatos betegségek gyulladásos bélbetegségek a máj, tüdő, vese betegségei kialakulás és prognózis

Oxidációs termékek, mint az oxidatív stress biomarkerei LIPIDFEHÉRJEDNSEtán, pentán a kilégzett levegőben Protein karbonilek (stabil, -80 o. C-on, 3 hónapig tárolhatók), lysin, arginin, prolin aldehid, keton származékai Thymine glycol TBARS Diszulfid csoportot tartalmazó vegyületek 2, 8, -hidroxiadenin Konjugált diének Keresztkötéseket hordozó fehérjék 8 -hidroxiguanin Aldehidek (MDA, acrolein, 4 HNE, 4 -ONE) Aldehid módosulatok 8 -nitro-, kloro-, bromo-, guanin Izoprostánok (F 2 -izoprosztánok) Dityrosin (vizelettel ürül, oxidatív status megítélésére) 5 -OH-uracil ox. LDL Oxysterolok (koleszterinlinoleát-hidroperoxid)

900 MHz NMR készülék, Birmingham, UK Mintaelőkészítés NMR vizsgálathoz (vékony boroszilikát üveg, 20 Hz)

Szabad gyökök képződésével járó folyamatok vizsgálati lehetőségei • Mérőmódszerek: – ESR/EPR, NMR spektroszkópia – Kemilumineszcencia, Fluoreszcencia – UV/látható abszorpciós spektrofotometria – LC-MS/MS, GC-MS/MS

ESR, paramágneses vegyületek közvetlen detektálása

Szabadgyökök ESR spektrumai Az elektronspin rezonancia - ESR (más elterjedt elnevezéssel elektron paramágneses rezonancia - EPR) egy olyan spektroszkópiai módszer, amellyel az elektronok energia-szintjeinek mágneses mezőben való felhasadása vizsgálható.

Az EPR/ESR technikák a ROS vegyületek vizsgálatában Elektron paramágneses rezonancia spektroszkópia

ROS (reaktív oxigén gyökök) vizsgálata EPR technikával Mariappan N, Elks CM, Haque M, Francis J : Interaction of TNF with Angiotensin II Contributes to Mitochondrial Oxidative Stress and Cardiac Damage in Rats. PLo. S ONE 7(10), (2012)

Szuperoxid gyök (O 2. - ) vizsgálata EPR technikával Mariappan N, Elks CM, Haque M, Francis J : Interaction of TNF with Angiotensin II Contributes to Mitochondrial Oxidative Stress and Cardiac Damage in Rats. PLo. S ONE 7(10), (2012)

Peroxinitritek (OONO- ) vizsgálata EPR technikával b c a Mariappan N, Elks CM, Haque M, Francis J : Interaction of TNF with Angiotensin II Contributes to Mitochondrial Oxidative Stress and Cardiac Damage in Rats. PLo. S ONE 7(10), (2012)

Lipidperoxidációs termékek vizsgálati módszerei • Nagy hatékonyságú folyadék-kromatográfia • Gáz-kromatográfia, kapcsolva tömegspektrometriával (GC -MS, LC-MS/MS, MALDI-TOF) • ELISA • TBAR esszé, LC-GC izoláció után

Lipid peroxidáció vizsgálata gyulladásos bélbetegségekben L Kruidenier, I Kuiper et al. : Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants J Pathol 2003; 201: 28– 36.

Oxidatív stress celluláris és keringő biomarkereinek vizsgálata metabolikus szindrómában (szendvics ELISA) I Jialal, * S Devaraj, * B Adams-Huet, X Chen, et al. : Increased Cellular and Circulating Biomarkers of Oxidative Stress in Nascent Metabolic Syndrome. J Clin Endocrinol Metab 97: E 1844–E 1850, 2012

DNS származékok vizsgálata különböző betegségekben K. D. Jakob et al. : Markers of oxidant stress that are clinically relevant in aging and age-related disease. Mechanisms of Ageing and Development 134 (2013) 139– 157

Karboxilált fehérjék és a redukált gluthation (GSH) vizsgálata az egyes betegségekben K. D. Jakob et al. : Markers of oxidant stress that are clinically relevant in aging and age-related disease. Mechanisms of Ageing and Development 134 (2013) 139– 157

Izoprosztánok vizsgálata különböző betegségekben K. D. Jakob et al. : Markers of oxidant stress that are clinically relevant in aging and age-related disease. Mechanisms of Ageing and Development 134 (2013) 139– 157

Antioxidáns: Védekezés az oxidatív stressz káros következményeivel szemben 3 1 4 2 E. Niki. : Assessment of Antioxidant Capacity in vitro and in vivo/ Free Radical Biology & Medicine 49 (2010) 503– 515

Antioxidáns státusz felmérésére alkalmas vizsgálati tesztek

Leggyakoribb antioxidáns biomarkerek • Preventív antioxidáns hatású vegyületek meghatározása : – fémionok megkötésére alkalmas fehérjék : coeruloplasmin, albumin, transferrin, ferritin • Kis méretű antioxidáns molekulák : bilirubin, húgysav • Antioxidáns enzimszintek (scavengerek) mérése spektrofotometriás, kinetikus módszerekkel (SOD, Kataláz, GPx, Glutathion reduktáz, stb. ) • Antioxidáns eredetű oxidált vegyületek: tokoferil-kinon(TQ), 5 -nitro-γ-tokoferol, allantoin, biopyrrin • Oxidált/redukált formák arányainak meghatározása (GSH/GSSG, TQ/TQH 2, UQ/UQH 2 )

Antioxidánsok a vérplazmában

Antioxidáns kapacitás meghatározása fémionok redukciója segítségével • FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) – Vas ionok redukciója • CUPRAC (Cupric Reducing Antioxdant Power) – Réz ionok redukciója • A redukciós folyamat során reaktív ionok keletkeznek, melyek hatására a vizsgált antioxidánsok prooxidánsként viselkedhetnek. • HPLC társítva elektrokémiai detektálással

Antioxidáns kapacitás megítélése • Biológiai anyagok, folyadékok, növényi kivonatok • Globális tesztek: – – – Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) Total radical antioxidant parameter (TRAP) Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) Total oxyradical scavenging capacity (TOSC) Össz-scavenger kapacitás (TSC)

Össz-scavenger kapacitás mérőmódszerének alkalmazása • Gyulladásos bélbetegségek vizsgálatában a vörösvértestekben és plazmában meghatározott kemilumineszcens fényintenzitás változás mérése (Blázovics és mtsai. 1999. Clin Chem 45. ) • Növényi kivonatok antioxidáns hatásának megítélése (Lugasi A. , Szentmihályi K. , Kocsis I. 2000, 2002. Acta Alimentaria 29, 31) • Alkoholos májbetegek redox-homeosztázisának megítélése (Hagymási és mtsai. 2000. Eur. J. Gastroenterol. Hepatology 12. )

Kocsis I. : Doktori Értekezések 541, Bp. , 2004

Kemiumineszcens aktivitás vizsgálata alkoholos májbetegségben (plazma, vvt-k) (Hagymási és mtsai. 2000. Eur. J. Gastroenterol. Hepatology 12. )

Gyökfogó kapacitás meghatározásának spektrofotometriás lehetőségei • Reakció „stabil” gyökképző vegyületekkel – Galvinoxyl, – DPPH ( 2, 2 -difenil-1 -pikrilhidrazid) – ABTS (benzthiazolin-szulfonsav) – AAPH (azo-2 -amidinopropán)

GSH, albumin, húgysav antioxidáns hatásának vizsgálata ORAC metodikával (pyrogallol-vörös és AAPH* gyök kölcsönhatásának követésével) 1: 25 umol/L Albumin 2: 75 umol/L Albumin 3: 150 umol/L Albumin 1: 10 umol/l GSH 2: 100 umol/L Albumin 3: 1 m. M / UA 1 kontroll 3 3 2 kontroll Torres , P. Galleguillos , E. Lissi , C. López : Antioxidant capacity of human blood plasma and human urine: Simultaneous evaluation of the ORAC index and ascorbic acid concentration employing pyrogallol red as probe. Bioorganic & Medicinal Chemistry Volume 16, 2008. 9171 - 9175 2 1

Aszkorbinsav ORAC értékeinek meghatározása pyrogallol-vörös AAPH* gyök hatására bekövetkező bomlásának időbeni követésével (Spektrofotometria) plazma vizelet P. Torres , P. Galleguillos , E. Lissi , C. López : Antioxidant capacity of human blood plasma and human urine: Simultaneous evaluation of the ORAC index and ascorbic acid concentration employing pyrogallol red as probe. Bioorganic & Medicinal Chemistry Volume 16, 2008. 9171 - 9175

Aszkorbinsav gyökfogó kapacitásának vizsgálata (ORAC, spektrofotometria) 1: 2, 5 umol/L 2: 5, 0 umol/L 3: 10, 0 umol/L 4: 15, 0 umol/L 5: 20, 0 umol/L 4 1 2 3 5 Torres , P. et al: Antioxidant capacity of human blood plasma ………… Bioorganic & Medicinal Chemistry Volume 16, 2008. 9171 - 9175

Gyökfogó kapacitás (ORAC) metodika alkalmazása növényi kivonatok vizsgálatában • Több, mint 300 növényi exractum besorolása ORAC értékek alapján – TE/100 mg: trolox equivalens /100 g – US Department of Agriculture website (www. ars. usda. gov. /SP 2 User. Files/Place/12354500/Data/O RAC/ORAC 07. pdf)

Elfogadott mérőmódszerek: HPLC Kapilláris ELFO

• vese- és kardioprotektív hatás • bélmucosa védelme • • Vitaminok (C, E) GSH észterek transz β-karotin N-acetyl-cystein Glutamin (glutamát forrás) Szelén Genistein és Daidzein (szójamag) Quercetin

SDAAF : zsírtalanított alkoholos szójaliszt kivonat Lexirin : vizes szójaliszt kivonat

nyers szójaliszt alkoholos kivonat vizes kivonat

Az oxidatív stressz vizeletben vizsgálható biomarkerei, „validitási” problémák • F 2 -isoprostanes: q megfelelően informatív ox. stress biomarker, ismert intra-, inter individuális variabilitással • MDA: q Nem elég szenzitív, sem szérum, sem vizeletmintában, humán vizsgálatok alapján • 8 -oxo-Guanidin: q Intra-, inter- individuális variabilitása nem megfelelően tisztázott humán vizsgálatokban q Állatkísérletek eredményei alapján megbízható biomarker • allantoin: q Előnyös stabilitási jellemzők különböző tárolási körülmények között q A variabilitási jellemzők pontos meghatározása további vizsgálatokat igényel D. Il'yasova et al. : Urinary biomarkers of oxidative status. Clinica Chimica Acta 413 (2012) 1446– 1453

8 -oxo-Guanidin biológiai variabilitásának vizsgálata (isocratic LC–MS/MS system (positive-ion MRM mode) a. , Adott napon belüli variabilitás (4 mintavétel/24 óra) K. Lee et al. / Clinica Chimica Acta 411 (2010) 416– 422 b. , Napok közötti variabilitás (5 egymást követő napon, azonos időben történő mintavétel)

TBARS 8 -OH-deoxoguanidin TAS Hatásfokmérő karakterisztika (ROC görbe – Receiver operating characteristics curve) D. Diakowska et al. : Evaluation of 8 -hydroxydeoxyguanosine, thiobarbituric acid-reactive substances…/ Clinical Biochemistry 41 (2008) 796– 803

TBARS, 8 -OHd. G és TAS biomarkerek, mint lehetséges diagnosztikus paraméterek jellemzői D. Diakowska et al. : Evaluation of 8 -hydroxydeoxyguanosine, thiobarbituric acid-reactive substances…/ Clinical Biochemistry 41 (2008) 796– 803

Oxidatív stressz mértékének vizsgálata • A szabadgyökök hatására bekövetkezett oxidatív károsodás mértéke – Lipiperoxidációs termékek – DNS-károsodás következtében felszaporodó vegyületek (vizeletben): 8 -hydroxy-deoxy-Guanosine • Antioxidáns védelem , kapacitás vizsgálata – Teljes vér Glutathion tartalma – Szabadgyökök eliminálását végző enzimek : szuperoxid dizmutáz, glutathion peroxidáz Related profiles: Coenzyme Q 10 Nutr. Eval® FMV ONE (Optimal Nutritional Evaluation) FMV™ Oxidative Stress Analysis 2. 0 (Blood) https: //www. gdx. net/product/nutreval-fmnutritional-test-blood-urine

Külföldi példa: „Oxidative Stress Analysis 2. 0 (Blood)” CPT CODES: Cysteine Glutathione, Peroxidase Lipid Peroxides Sulfate Superoxide dismutase (SOD) Total Antioxidant Capacity, TAC 82136 82978 84311 84311 https: //www. gdx. net/learngdx/ report-review/ox-stress https: //www. gdx. net/product/nutreval-fmnutritional-test-blood-urine

Köszönöm a figyelmet !