STTA Ames mutagenitsi vizsglat In vivo mikronukleusz Tarnczai

STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea tarnoczai. timea@okbi. antsz. hu 2012. 11. 27.

Mutációk n n n Mindig genetikai eredetű (környezeti vagy endogén hatás) Minél több mutáció jön létre, annál nagyobb a rák kialakulásának valószínűsége Sok vegyi anyag kis dózisban mutagén, nagy dózisban citotoxikus→genotoxikus anyagok

n Tautomerizáció

Mutagén tényezők n n Fizikai tényezők: ionizáló és nem-ionizáló sugárzás Ionizáló: rövid hullámhossz, atomokat ionokká alakítja→vízből szabadgyökök keletkeznek→intenzív oxidáció Determinisztikus (küszöbdózis) és sztochasztikus hatás (vagy kialakul, vagy nem, dózissal nő a valószínűség) Nem-ionizáló: hosszú hullámhossz (pl. UV, timin dimerizáció)

n kémiai tényezők: n hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek (gyűrűs szerkezetű anyagok, beépülnek) alkiláló vegyületek deamináló vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba pl. 5 -brómuracil (5 BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes párosodni, tranzíciót okoz

n Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz pl. salétromossav citozin→uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranzíciót okoz

n Alkiláló szerek: alkil (-CH 3, -CH 2 -CH 3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl. etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja n n a 6 -etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4 -etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

Környezeti mutagén anyagok élelmiszeradalékok: nitritek, nitrátok nátriumbisziulfit ciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H 2 O 2 femnilén-diaminotoluol diaminoanizol gyógyszerek: citosztatikumok altató és nyugtató szer fertőtlenítőszerek (formaldehid, H 2 O 2) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidok etilén-iminek acetaldehid Akrilaldehid propán szulfon Dimetil-szulfát Dietil-szulfát dimetil-nitrózamin hidrazinok uretán Etilén-klorid Vinil-klorid Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémek azbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

STTA (stable transfected transcriptional activation assay) n n n Endokrin diszruptorok azonosítására OECD 455 guideline Hormonreceptorok citoplazmában Szubsztrát kötődés Dimerizáció és aktiválódás Receptor-ligand komplex DNS promóterhez kötődik→transzkripció aktiválása

STTA assay-ben: n h. ERα-He. La-9903 sejtvonal n Legrégebbi humán sejtvonal n Méhnyakrákból származik (Henrietta Lacks) n He. La genetikailag módosított változata → ösztrogén reszponzív elemek, ösztrogén receptor

n n n n DNS-ben szintetikus promóter kötőhellyel Promóter után luciferáz gén→hormon hatású anyag kötődése esetén átíródik Szubsztrát (luciferin) hozzáadása Fény szabadul fel, amit mérni lehet (luminométer) Minél nagyobb a fény aktivitása, annál nagyobb a hormonreceptor hatás (1 μM határig) Pozitív és negatív referencia anyagok (határokon belül!) Pozitív és negatív kontroll

dimerizáció ligandum citoplazma HR sejtmag Full length of h. ER luciferáz 5’ h. ER vegyület 5’ luciferáz 3’ fény Luciferáz aktivitás ERE Luciferinluciferáz reakcó 3’ ERE HR: Hormon Receptor h. ER: humán ösztrogén receptor ERE: Estrogen-Responsive Element 0 10 -12 10 -11 10 -10 10 -9 M

Bakteriális reverz mutagenitási vizsgálat n n n n Bruce Ames 1970 -es évek elején Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas (genetikai betegségek) Prokarióta sejtek Aminosav szintetizáló képesség károsodott Öröklött génmutáció reverziója A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció) Minél több mutációt okoz egy anyag, annál valószínűbb, hogy pont az a triplet mutálódik

n. Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) n. Metabolikus aktivizálás kívülről n. Citokróm P 450 oxidációs rendszer (májban) n S 9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok n. Enzim termelődésének növelése→inducer n. Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) n. Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll)

Teszttörzsek n n n Escherichia coli és Salmonella typhimurium E. coli triptofán mutáns (WP 2 uvr. A), S. typhimurium hisztidin mutáns (TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537) Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek Negatív és pozitív kontroll kell

Egyéb genetikai módosítások n n n Cél az érzékenység növelése Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása uvr. A/uvr. B mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja p. KM 101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia Törzsek ellenőrzése szükséges

n n Előinkubációs és lemezöntéses módszer Speciális anyagoknál módosítások

A vizsgálat menete n n n n 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar Minimál agaros Petri-csészére önteni Top agar megszilárdulása Inkubálás 48 -72 óráig 37°C-on Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje 20 -40 perc) Telepszámolás, mikroszkópos értékelés Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés)

Aminosav igény ellenőrzése (minimál agar) Ampicillin rezisztencia, kristályibolya- és UV-érzékenység (tápagar) Spontán mutáció (negatív kontroll) Indukált mutáció (pozitív kontroll)

Negatív kontroll, normál baktériumpázsit 25μg/lemez glutáraldehid toxikus hatása

Ames II. n n n módosított Ames vizsgálat 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz. ) baktériumok és teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a p. H indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) automatizált, kisebb mennyiség is elég

In vivo mikronukleusz n n n Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz n n Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben OECD Guideline 474

n n A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése Normocita→polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk A mikronukleusszal rendelkező eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal

n n n Állatok kezelése subcutan (bőr alatt) vagy per os (szájon át) Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal Kezelés egyszer→leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) Femur preparálás→csontvelő fötális borjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítés

n Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Normocita Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal és anélkül Egy polikromáziás eritrocita az érett eritrociták között

n n n Értékelés mikroszkóppal Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz PCE/NCE arány 0, 1 felett kell legyen A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány Statisztikai értékelés