Spectrophotometer Determination of Protein concentration Laboratory of Lipid

Spectrophotometer & Determination of Protein concentration Laboratory of Lipid Biochemistry 12 th

Lowry protein assay Lowry reagent 시약에 의한 발색은 단백질과 알칼리성 구리와의 반응과 단백질의 아미노산에 의한 환원반응으로 생긴다. 1 단계 Biuret reaction : 알칼리 용액에서 Cu 2+와 protein peptide bond 간에 complex를 형성시켜서 Cu 2+가 Cu+로 환원 된다. 2 단계 Folin-Ciocalteu reaction : Cu+와 tryptophan, tyrosine, cysteine의 radical group이 Folin-Ciocalteu reagent (phosphomolybdate and phosphotungstate complex(노란색))를 환원시켜 서 진한 청색으로 변한다. (yellow→deep blue) 단백질에 750 nm 파장의 빛을 통과 시켜 흡광도를 측정하여 standard curve를 그린다. 시료의 흡광도를 측정한 후 standard curve와 비교하여 시료의 농도를 예측한다.

Material and Method 1. Sample protein 1: 5 dilution (in lysis buffer) 2. Standard protein (BSA) 5 ul 3. Sample protein 5 ul 4. Lowry reagent A 25 ul 5. Lowry reagent B 200 ul 6. Incubation at RT for 15 min 7. 750 nm에서 흡광도 측정

SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)

SDS-PAGE gel Comb 여기에 정량한 단백질 넣음 Stacking gel Separating gel