Soyez les bienvenu s 1 Soutenance de Thse
Soyez les bienvenu s 1
Soutenance de Thèse Pour l’obtention du diplôme de LBA Laboratoire de Biochimie Appliquée DOCTEUR EN SCIENCES Filière: Biologie Option : Microbiologie Thème Caractérisation et évaluation des activités biologiques de l’huile d’olive de variétés algériennes cultivées dans la région de Bejaia Présentée par: Mme LAINCER-MERDJANE Firdousse Dirigée par: Pr TAMENDJARI 2 A
Introduction Partie expérimentale Ø Matériel et méthodes Ø Discussion des résultats Conclusion et perspectives 3
s Introduction Europe Asie Le régime alimentaire méditerranéen Afrique 4
Introduction Stérols Triglycérides et acides gras Tocophérols Composés phénoliques Jus du fruit Pigments de l’olivier 5
Introduction Effets antimicrobiens Protège la peau Effets nutritionnels Effets Maladies cardiovasculaires antioxydant Alzheimer Intérêts de la consommation Athérosclérose d’huile d'olive Cancer du colon 6
Introduction En 2009, Détermination d’informations sur 32 les millions caractéristiques de chaque d’oliviers génotype. En 2015, 35 millions d’oliviers Composants majoritaires et minoritaires Kabylie Gamme de variétés Variation Sélection variétale exercée par l’homme Diversité de climats et de reliefs 7
Objectifs Ø Analyse qualitative et quantitative des composés majeurs et des composés mineurs de vingt-six échantillons des huiles d'olive (19 variétés au total). Ø Contribution à la détermination et la discrimination de l'origine géographique des variétés par RMN Ø Effet de la variété sur le pouvoir antioxydant et antimicrobien des huiles et extraits méthanoliques par différentes approches. 8
Partie Expérimentale 9
Echantillonnage Akfadou Amizour Boukhlifa Leflay Ouzellaguen Sidi aich Sedouk Beni Maouche Takerietz Chemini Allaghane Tazmalt Boudjellil 10
Les caractéristiques climatiques de chaque région Humide Sub. Humide Semiaride 11
Echantillonnage Vingt-six échantillons de fruits d'oliviers Dix-neuf variétés différentes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Cultivar (cv. ) Bouichret Agrarez Limli Blanquette de Guelma Limli Tabelout Takesrit Bouchouk Guergour Bouchouk Chemlal Zeletni Almzeir 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Cultivar (cv. ) Azeradj Takesrit Bouchouk Sidi -Aich Azeradj Tabelout Sigoise Chemlal Aberkane Variété X Aimel Souidi Rougette de Mitidja Azeradj 12
Analyses réalisées sur les olives Olives Indice de maturité des olives Largeur Analyses pomologiques Mahhou et al. , (2012) Rahmani, (1996) Longueur Poids 13
Cultivar (cv. ) Indice de de Indices Maturité maturité Poids Longueur des Largeur des Longueur/largeur desfruits(g) fruits (mm) du fruit Sub-humide 1 Bouichret 3, 87 jk 2, 00 ef 24, 00 h 15, 00 g 1, 60 fg 2 Agrarez 2, 80 ef 2, 22 f 14, 80 g 1, 29 abc 3 Limli 3, 47 hi ° Leflaye 0, 78 19, 20 ef 4 Blanquette de Guelma 1, 90° 1, 97 ef 5 Limli 1, 94 ab 6 Tabelout 3, 91 jk 7 Takesrit 3, 72 j 21, 00 15, 40 1, 36 ü Sphérique (<1, 25) Effet 1, 65 17, 00 13, 00 de la région 1, 31 Allaghene ü Ovoïde (1, 25 -1, 45) 3, 00 21, 60 14, 70 1, 54 ü Allongée (> 1, 45) 0, 71 17, 30 11, 20 1, 54 8 Bouchouk Guergour 9 Bouchouk 12, 00 1, 53 COI (2000) Essiari et al. , (2014) Blanquette de Guelma 18, 40 def bcd defg g g abcde cd bcd def abcd h g efg ° cd bc efg 1, 94 ab 1, 61 cd 18, 40 de 12, 60 cde 3, 94 jk 1, 64 cd 10 Chemlal 3, 98 k 1, 43 bc 21, 00 Chemlal Fruits 11 Chemlal 3, 95 jk 1, 50 bc 1, 60 cd 12 Zeletni 13 Almzeir Azeradj (17) 3, 88 2, 10 bc jk 0, 77° 3, 50 i 1, 97 ef 15 Takesrit 2, 64° 1, 42 bc 2, 92 11 échantillons 3, 30 17 Azeradj 18 Tabelout 19 Sigoise g abcdef 15, 10 Semi-aride 1, 39 Semi-aride à basse masse 11, 00 1, 45 bc bcdefg 15, 40 b 11, 30 bc 1, 36 abcde 18, 00 de 13, 00 def 1, 38 abcdef 16, 10 bc 10, 70 b 1, 51 cdefg ef fg 1, 33 abcde cd bcd 1, 47 bcdefg Effet variétal 19, 10 14, 30 facteurs génétiques; 17, 40 11, 80 • Allongé 1, 26 b 20, 00 fg 14, 90 g 1, 34 abcde 2, 13 ef 21, 70 g 18, 00 h 1, 20 a 3, 24 g 1, 95 ef 21, 50 g 13, 30 def 1, 65 g 3, 40 ghi 1, 89° 21, 80 g 17, 30 h 1, 26 ab 1, 44 bc 17, 30 cd 12, 00 bcd 1, 44 bcdefg 2, 46 g 25, 00 h 18, 00 h 1, 38 abcdef 1, 36 abcde 14 1, 56 efg f gh 3, 80 14 21 Aberkane échantillons 3, 81 20 Chemlal 16, 00 bc • Sphérique 14 Azeradj 16 Bouchouk Sidi -Aich g 1, 46 bcdefg jk jk • Ovoïde 22 Variété X 2, 65° 0, 74° 11, 90 a 8, 70 a 23 Aimel 3, 89 jk 1, 55 c 17, 14 cd 11, 90 bc
Extraction de l’huile des variétés Effeuillage et lavage des olives Oléodoseur Conservées à 4°C 15
Analyses réalisées sur les huiles d’olives 0, 053 - 0, 294 % Acidité C. C. E (2685/91) Indice de peroxyde C. C. E (2685/91) 2 - 10 meq O 2/Kg Absorbances dans l’UV COI (1996) K 232= 0, 983 - 2, 003 K 270= 0, 082 - 0, 207 16
Indices de peroxyde Absorbances aux UV Acidité Catégorie « extra vierge » . 17
Analyses réalisées sur les huiles d’olives Minguez. Mosquera et al. , (1991) Dosages Composés phénoliques Pigments Tocophérols Acides gras 18
Tableau 2: Teneurs en chlorophylle et caroténoïdes(mg kg-1) Cultivar (cv. ) Chlorophylle. Classification Caroténoïdes Chloro/ Carot -1 a± 0, 01 Chlorophylle < 2 mg kg 0, 22 ab. Criado 1 Bouichret ± 0, 06 0, 11 2 et al. , (2004), f ghi 2 Agrarez 0, 54 ± 0, 02 0, 54 ± 0, 01 1 Cerretani et al. , (2008). -1 bcd± 0, 07 3 Limli 0, 34 0, 18 abc± 0, 01 1, 88 Caroténoïdes < 1 mg kg g f 0, 42 ± 0, 05 4 Blanquette de Guelma 0, 80 ± 0, 17 1, 90 5 Limli 0, 36 bcde± 0, 07 0, 24 cd± 0, 01 1, 5 Gargouri et al. , ab ab 6 Tabelout 0, 22 ± 0, 03 0, 13 ± 0, 01 1, 69 k± 0, 13 (2013) 7 Takesrit 3, 12 1, 60 l± 0, 00 1, 95 Effet région i i 8 Bouchouk Guergour 1, 13 ± 0, 07 0, 60 ± 0, 17 1, 88 9 Bouchouk 0, 52 ef± 0, 02 0, 34 e± 0, 01 1, 53 gh gh 10 Chemlal 0, 84 ± 0, 02 0, 51 ± 0, 01 1, 64 Takesrit Sidi Aich 11 Chemlal 0, 40 cdef± 0, 08 0, 23 cd± 0, 03 1, 74 -1 gh ghi CHL= 3, 12 mg kg 12 Zeletni 0, 83 ± 0, 01 0, 52 ± 0, 00 1, 60 13 Almzeir 0, 49 f± 0, 04 0, 30 de± 0, 01 CARO= 1, 6 mg 1, 63 kg-1 h hi 14 Azeradj 0, 98 ± 0, 03 0, 57 ± 0, 01 1, 72 15 Takesrit 0, 86 gh± 0, 04 0, 46 fg± 0, 02 1, 87 ef j 16 Bouchouk Sidi -Aich 0, 50 ± 0, 12 0, 74 ± 0, 06 0, 67 Sub 17 Azeradj 0, 29 abc± 0, 01 0, 15 abc± 0, 01 1, 93 humide def bcd 18 Tabelout 0, 50 ± 0, 01 0, 21 ± 0, 01 2, 38 19 Sigoise 0, 30 bc± 0, 01 0, 24 cd± 0, 01 1, 25 ef e 20 Chemlal 0, 51 ± 0, 01 0, 33 ± 0, 01 1, 54 21 Aberkane 0, 33 bc± 0, 05 0, 12 a± 0, 01 2, 75 g ghi 22 Variété X 0, 73 ± 0, 025 0, 52 ± 0, 01 1, 40 23 Aimel 0, 34 bcd± 0, 03 0, 28 de± 0, 014 0, 89 gh j 24 Souidi 0, 88 ± 0, 03 0, 74 ± 0, 003 1, 19 Sub 25 Rougette de Mitidja 1, 58 j± 0, 14 0, 90 k± 0, 031 1, 75 19 Aride 26 Azeradj 0, 15 a± 0, 01 0, 16 abc± 0, 004 0, 94 Bouchouk sidi aich, Aimel • < 1, Couleur jaune 8 échantillons • 1 -1, 6: Couleur jaune vert 16 échantillons • >1, 6: Couleur verte
Dosage des tocophérols Rovellini et al. , (1997) Analyse Séparation HPLC inverse Colonne Allsphere ODS-2 (Alltech) (25 cm x 4, 6 mm, taille des particules: 5μm La phase mobile est composée: acétonitrile /méthanol (1/1) à un débit de 1, 3 ml min-1 20
δγβTocophérol Alpha toco totaux α-Tocophérol total oxydées 1 Bouichret 0, 15 ab 0, 64 a 1, 25 a 207, 52 a 209, 57 a 4, 31 b 2 Agrarez 0, 12 ab 2, 16 ab 1, 78 bc 220, 38 ab 224, 44 ab 18, 71 k 3 Limli 1, 13 g 47, 33 k 2, 28 def 300, 02 g 350, 77 fg 4, 61 bc ØAlpha toco 4 Blanquette de Guelma 0, 27 abc 9, 65 g 3, 92 k 486, 88 j 500, 73 j 3, 26 a 5 Limli 0, 10 a 1, 59 ab 1, 58 b 279, 10 cde 282, 38 def 5, 46 cd 6 Tabelout 0, 08 a 0, 90 a 2, 14 de 300, 95 def 304, 08 fg 7, 49 g -1 < 25, 37 mg kg 564, 91 j 7 Takesrit 1, 34 h 59, 13 l 3, 38 j 501, 05 k 25, 37 o 8 Bouchouk Boskou. Guergour (2010), 0, 31 bcd 13, 33 h 2, 47 fg 233, 87 bc 249, 98 abc 22, 29 n 9 Bouchouk 0, 19 abc 4, 18 cd 2, 88 h 263, 38 cd 270, 63 cdef 4, 60 bc catégorie Extra- abc 10 Chemlal 0, 19 6, 69 efg 3, 27 ij 263, 96 def 274, 12 efg 12, 32 i vierge. Ø -1 Delta toco ≥ 200 mg 11 Chemlal 0, 22 abc 4, 92 d kg 2, 41 efg 204, 83 a 212, 39 a 6, 69 efg Ø 0, 09 Gamma toco a 12 Zeletni 2, 49 abc 1, 61 b 278, 97 cde 283, 16 def 7, 21 g g Ø Beta toco 13 Almzeir 1, 05 46, 92 k 1, 58 b 250, 21 def 299, 76 bcd 6, 31 ef 14 Azeradj 0, 15 ab 1, 17 ab 1, 99 cd 322, 84 fg 326, 16 g 4, 09 b 15 Takesrit 0, 70 f ØTocophérols 42, 21 j 2, 05 d 271, 85 efg 316, 81 cdef 7, 15 fg 10 g d'huile d'olive de la oxydés 16 Bouchouk Sidi –Aich 0, 13 ab 1, 77 ab 3, 38 j 377, 88 h. Caracterisation 383, 17 h 20, 95 m variété Souidi cd 17 Azeradj 0, 35 7, 33 ef peut 3, 37 j 257, 66 cd 268, 72 bcde 6, 60 efg varietale efg besoin couvrir du 18 Tabelout 0, 35 cd 50% 7, 87 4, 08 k 262, 33 cde 274, 65 cdef 4, 75 bc h quotidien en vitamine E hi 19 Sigoise 0, 51 e 13, 75 3, 04 384, 87 h 402, 17 h 12, 03 i 20 Chemlal 0, 22 abc 8, 95 fg 3, 50 j 317, 39 fg 330, 07 g 12, 11 i 21 Aberkane 0, 44 de 7, 18 ef 2, 29 def 220, 24 ab 230, 16 ab 5, 90 de 22 Variété X 0, 28 abc 9, 59 g 3, 32 j 416, 84 i 430, 04 i 4, 61 bc 23 Aimel 1, 01 g 46, 92 k 2, 13 de 252, 24 def 302, 31 bcd 16, 16 j -1 k mg kg 581, 84 l 24 Souidi 0, 09 a 3, 23 bcd 5, 46 l 573, 05 573, 04 9, 27 h Rougette dede. Mitidja mg kgp -1 25 Rougette Mitidja 1, 58 i 18, 52 i 9, 16 m 540, 57 k 569, 84 k 64, 03 21 26 Azeradj 0, 15 ab 6, 67 e 2, 63 g 259, 57 cd 269, 02 cde 20, 15 l Cultivar (cv. ) Souidi
Figure 1: Analyse en composantes principales basée sur la composition en tocophérols des différents échantillons des huiles d'olives. Variance cumulée Riches en alpha tocophérols 90, 02% Région Climat semi-aride basse altitude 22
Détermination du profil en acides gras Préparation des Esters méthyliques Injection en CPG Transmethylation à froid (KOH/ Na. OH) Port d’injection split/splitless Detecteur: FID Colonne capillaire (30 m) Gaz vecteur: azote Débit: 1, 3 ml/min 23
Cultivar (cv. ) CC 16: 0 CC 18: 1 C 18: 2 C 18: 3 AGMI AGPIC 18: 1/C 18: 2 AGMI AGPI /C 18: 2 AGS 1 Bouichret 13, 39 f 67, 64 k 12, 75 o 0, 77 i 17, 31 h 69, 16 m 13, 51 p 5, 31 h 2 Agrarez 12, 47 c 72, 26 r 8, 78 f 0, 67 e 16, 44 f 74, 02 s 9, 45 f 8, 23 o 3 Limli Blanquette de Guelma Limli 17, 36 k 64, 80 g 11, 28 k 0, 74 h 20, 90 n 67, 09 h 12, 02 l 5, 74 j 12, 54 c 65, 61 h 16, 56 u 0, 76 i 16, 15 e 66, 54 g 17, 32 v 3, 96 d 10, 59 a 76, 80 u 6, 95 b 12, 15 q Tabelout 11, 11 b 69, 93 p 7 Takesrit 18, 09 m 8 Bouchouk Guergour 9 4 5 ØStabilité oxydative 12, 55 0, 80 15, 33 71, 31 0, 63 d 14, 90 c 78, 07 v n j d p 13, 34 o 5, 57 i 62, 86 d 11, 85 l 0, 93 o 22, 28 q 64, 95 d 12, 78 m 5, 31 h 14, 14 g 65, 91 i 14, 11 s 0, 86 l 17, 60 i 67, 38 i 14, 97 t 4, 67 f Bouchouk 17, 75 l 58, 06 a 17, 87 x 0, 71 g 20, 57 m 18, 57 y 3, 25 a 10 Chemlal 16, 86 j 63, 52 f 13, 65 r 0, 59 a 19, 46 l ≥ 60, 87 a 14, 23 s 4, 66 f 11 Chemlal 15, 18 i 66, 17 j 13, 55 q 0, 58 a 17, 62 i 68, 25 l 14, 13 r 4, 88 g 12 Zeletni 16, 92 j 68, 62 m 8, 29 e 0, 70 g 20, 49 m 70, 53 n 8, 99 e 8, 28 o 13 Almzeir 17, 33 k 63, 04 e 13, 16 p 0, 70 g 20, 92 n 65, 23 e 13, 85 q 4, 79 g 14 Azeradj 13, 08 e 70, 32 q 9, 57 h 0, 73 h 17, 84 j 71, 66 r 10, 30 h 7, 35 m 15 Takesrit 17, 68 l 65, 75 hi 10, 22 i 0, 60 b 21, 32 o 67, 88 k 10, 81 i 6, 44 k 16 Bouchouk Sidi –Aich 14, 78 h 69, 68 o 8, 95 g 1, 00 p 18, 49 k 71, 47 q 17 Azeradj 69, 24 n 12, 00 m 0, 91 n 16, 23 e 70, 87 o 18 Tabelout 17, 57 l 67, 82 l 8, 16 d 0, 70 g 20, 74 n 19 Sigoise 15, 09 i 61, 54 c 17, 22 w 0, 89 m 20 Chemlal 18, 32 n 61, 14 b 14, 54 t 21 Aberkane 11, 07 b 76, 44 t 22 Variété X 17, 27 k 23 Aimel 6 24 Souidi Rougette dede 25 Rougette de Mitidja 26 Azeradj < 18, 32% 12, 83 d 6, 32 b 60% 66, 31 f g < 9, 95 19% 7, 79 n 12, 91 n 5, 77 j 70, 41 n 8, 86 d 8, 32 o 17, 38 h 64, 52 c 18, 11 x 3, 57 c 0, 87 l 20, 88 n 63, 72 b 15, 41 u 4, 20 e 6, 97 c 0, 69 f 14, 61 b 77, 74 u 7, 65 c 10, 97 p 63, 07 de 13, 13 p 0, 70 g 20, 90 n 65, 27 e 13, 83 q 4, 81 g 17, 34 k 65, 67 h 10, 27 i 0, 61 c 21, 51 p 67, 62 j 10, 88 j 6, 39 k 17, 55 l 58, 21 a 16, 94 v 0, 93 o 21, 41 op 60, 73 a 17, 87 w 3, 44 b 13, 33 f 76, 82 u 3, 47 a 0, 85 k 16, 96 g 78, 73 w 4, 32 a 10, 47 a 73, 39 s 10, 92 j 1, 00 p 13, 09 a 74, 78 t 11, 92 k r 22, 17 24 6, 72 l
Figure 2: Analyse en composantes principales basée sur la composition en Acides gras. Variance cumulée AGS C 16: 0 C 16: 1 64, 45% C 17: 0 C 17: 1 Interaction cultivar et l'environnement C 18: 1 25
Dosage des composés phénoliques (Norme Grassi e Derivati, NGD, 2010; COI, 2010). La séparation chromatographique L’élution Phase inverse Spherisorb ODS -2 (5μm, 250 mm× 4. 6 mm). Gradient de: solvant A (eau: acide phosphorique, 99, 8: 0, 2, V/V), solvant B (méthanol) et le solvant C (acétonitrile). Les proportions des solvants varient de 96% (A)– 2% (B)– 2% (C) a 0% (A)– 50% (B)– 50% (C) Lecture 280 et 240 nm 26
Figure 3: Dosage des composés phénoliques totaux b Azeradj (26) Rougette de Mitidja (25) h Souidi (24) n c Aimel (23) s Variété X (22) m Aberkane (21) b Chemlal (20) a Sigoise (19) r Tabelout (18) Azeradj (17) d Bouchouk Sidi Aich (16) d Variétés Takesrit (15) Sigoise q Variation Azeradj (14) m Almzeir (13) i Zeletni(12) f Chemlal (11) f Chemlal (10) p Bouchouk (9) Profil 55, 0 – 1006, 7 mg kg-1 variétal o Bouchouk Guergour (8) m Takesrit (7) j Tabelout (6) e Limli (5) k Blanquette de Guelma (4) t Limli (3) l Agraraz(2) d Bouichert (1) g 0 200 400 600 800 Teneurs en polyphénols totaux (mg kg-1) 1000 Blanquette de Guelma 27
Figure 4: Chromatogramme HPLC de l'extrait méthanolique de variété des huiles d'olives Algériennes Dérivés des sécoiridoides (6, 7 et 9) (8) Lignanes Dérivés ligstroside (9) Dérivés Oleuropéine (6) Lutéoline (10) Apigénine (11) Acides phénolique (3) Alcools phénolique (1, 2) Flavonoïdes (10 et 11) Phénols oxydés (5) Oléocanthal (7) 28
Figure 5: Diagramme en boite à moustache représentant les teneurs en polyphénols en fonction des différents groupes. Dérivés d'oleuropéine 4 ≥ à 30 mg kg-1 Blanquette de -1 ≥ à 100 mg kg. Guelma ≤ à 10 mg kg -1 Acides 10 -20 mg kg-1 22 secoiridoides 4 4 mg kg-1 18 mg kg-1 21 9 8 Alcools phénoliques 20 29
Figure 6 : Diagramme en boite à moustache représentant les teneurs en polyphénols en fonction des différents groupes. 4 mg kg-1 18 Variété X Aberkane Tabelout 4 4 Dérivés Bouchouk d'oleuropéine mg kg-1 22 Flavonoïdes Guergour 21 9 8 20 Acides phénoliques 30
Analyse par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) Contribution à la détermination et la discrimination de l'origine géographique des variétés d'huile d'olive algériennes Comparaison des empreintes spectrales 31
Analyse par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) Les vingt-six échantillons ont fait objet d'une analyse par 1 H RMN Varian Unity Inova Spectrometer (700 MHz) Huiles d’olives Extraits phénoliques Ø Logiciel Matlab (The Mathworks Inc. , Natick, MA) Chloroforme deutérium (CDCl 3) DMSO deutérium (DMSO-d 6) Ø Logiciel Simca-P 13. 0 (Umetrics, Umeå, Sweden) pour la réalisation de l’ACP. 32
Figure 7: Spectre représentatif 1 HRMN d'un échantillon d'huile d'olive extra vierge. 2 1 Raffaele Sacchi et al. , 1996; 1997. University of Naples Federico II, Italia Luisa Mannina et al. , 2009. , University of Rome, Italia 4 8 10 9 5 7 3 6 Profil typique des signaux des triglycérides 33
Figure 8: Analyse en composantes principales selon les résultats obtenus par RMN des huiles d'olives différentes variétés. Variance cumulée Acide oléique 49, 3% Acides gras saturés Acide linoléique Les résultats obtenus nous permettent une entre les différentes huiles Climatdiscrimination humide Climat semi ou sub- selon les conditions climatiques -aride humide Acide oléique 34
Figure 9: Spectre représentatif 1 HRMN d'un extrait phénolique d’un échantillon d'huile d'olive extra vierge. Tableau XVI: Déplacement chimique, multiplicité des composés phénoliques identifiés dans les extraits méthanoliques des huiles d'olive par 1 HRMN (700 MHz, DMSO-d 6). Composés a Forme aldéhydique de ligstroside (5 S, 8 R, 9 S) b Forme aldéhydique de ligstroside (5 S, 8 S, 9 S) c Forme aldéhydique d'oleuropéine (5 S, 8 R, 9 S) d Forme aldéhydique d'oleuropéine (5 S, 8 S, 9 S) Composés aliphatique e Composés Forme dialdéhydique de ligstroside liée au groupement carboxyméthyle Composés f Forme dialdéhydique de l'oleuropéine liée au groupement carboxyméthyle aldéhydiques aromatique G (+) 1 -Acétoxypinoresinol H (+) Pinoresinol i Vanilline l Lutéoline m Apigénine n Hydroxytyrosol 35
Figure 10: Analyse en composantes principales selon les résultats obtenus par RMN des extraits des huiles d'olives différentes variétés. Variance cumulée 61, 5% Dialdéhydique de ligstroside liée au groupement carboxyméthyle ou bien oléocanthal Climat semi-aride Climat humide ou sub-humide Monoaldéhydique d'oleuropéine et ligstroside 36
Evaluation de la stabilité, les activités antioxydantes et antimicrobiennes 37
Évaluation de la stabilité oxydative des huiles d'olives Figure: Principe du Rancimat Flux d’aire de la durée Estimation de conservation des huiles d'olive Conductivité él év ée Fin du test Electrode ISO/6886/96 Eau distillée Rancimat Metrohm n° 743 Huile d’olive Bloc de chauffage (110 °C ) 38
Figure 11: Stabilité oxydative (h) des huiles d’olives différentes variétés Azeradj (26) Rougette de Mitidja (25) Souidi (24) Aimel (23) Sigoise variété X (22) Aberkane (21) Chemlal (20) Polyph enols Tabelout (18) Richesse en Temps Azeradj (17) Acide Teneurs élevées Sidi-Aich (16) polyphénols moyens s gras Takesrit (15) acides Azeradj (14) Stabilité • Polyphénolsen totaux (r =gras 0, 81). polyinsaturés Almzeir (13) de l’huile • Dérivés d'oleuropéine (r=0, 83). Zeletni (12) Chemlal Sigoise (19) Variétés Bouchouk Chemlal (11) Chemlal (10) Bouchouk (9) Blanquette de Guelma Bouchouk Guergour (8) Takesrit (7) Tabelout (6) Limli (5) Blanquette de Guelma (4) Limli(3) Agrarez (2) Bouichret (1) 0 10 20 30 13, 93 h 40 50 Heures 60 70 80 90 100 90, 56 h 39
Evaluation de l’activité antioxydante des extraits phénoliques Activité antiradicalaire contre le radical DPPH Benzie et Strain, (1996) Pouvoir réducteur (méthode FRAP) Brand-Williams et al. , (1995) 40
ue tt e an q Bl de Blanquette de Guelma m (4 ) li ( a Bo uc 5) lo Ta ut ho ke (6) uk s Gu rit (7 er ) go ur Bo (8 uc ) ho Ch uk em (9) la Ch l (1 em 0) la Ze l (1 1 le tn ) i( A 1 lm ze 2) i r A (1 ze Bo ra 3) dj uc ho Ta ( k uk es 14) r Si i di t (1 -A 5) ic h A (1 ze 6) ra Ta dj be (17 ) lo ut Si ( go 18) is Ch e ( em 19 ) la A l( be rk 20 ) va ane ri ét (21 ) é X (2 A Ro im 2) ug el et So (23 te ) de uid i( M 24 it id ) ja A (2 ze 5) ra dj (2 6) be Ta Li ) FRAP 0, 68 0, 41 0, 39 -0, 23 0, 78 0, 73 0, 51 0, 47 0, 05 0, 41 0, 34 0, 53 -0, 73 0, 85 Variétés de m Li ez t ) (2 (1 ) Gu li(3 ) el m a (4 ) Li m Ta li be (5) Bo lo uc Ta ut ho ke (6) uk s Gu rit (7 er ) go ur Bo (8 uc ) ho Ch uk em (9) la Ch l (1 em 0) la Ze l (1 1 le tn ) i( A 1 lm ze 2) ir A (1 ze Bo ra 3) uc dj ho Ta ( k uk es 14) ri Si di t (1 -A 5) ic h A (1 ze 6) ra d Ta j be (17 ) lo ut Si (1 8) go is e Ch em (19 ) la A l( be rk 20 ) va ane ri ( 21 ét ) é X ( 2 A Ro im 2) ug el et So (23 te ) de uid i M it (24 id ) ja A ( ze 25 ra dj ) (2 6) e tt ar 40 li( 3 ) ue nq Bl a re DPPH% Stabilité 0, 55 0, 54 0, 52 -0, 16 0, 83 0, 60 0, 40 0, 17 0, 09 0, 46 0, 41 0, 53 -0, 71 gr A ch ui Bo % 50 m m Li (2 ) (1 μmol tro/ kg 60 el t ez ar gr Gu A re ch ui FRAP Bo 100 90 99, 22 de % corrélation Tableau : Coefficients 80 70 Poly HT tot T 30 400 300 200 Variétés 82, 90 % 10 0 95, 70 % Dér Ac Stabili FRA DPP Oleu oleur Oleo Lign Flavo Lute Apig IC 50 ligs phen té P H o 20 Ortho. Dérivés EC 50 diphénols -0, 62 -0, 27 0, 05 -0, 63 -0, 61 -0, 47 -0, 31 -0, 15 -0, 36 -0, 33 -0, 39 1 d'oleuropeine 700 DPPH 0, 63 0, 51 0, 44 -0, 01 0, 88 0, 66 0, 49 0, 11 0, 10 0, 31 0, 26 0, 39 -0, 84 0, 83 0, 77 1 609, 96 550, 16 539, 96 600 μmol tro/ μmol 500 kg tro/ kg Riche en polyphé polyph nols Tabelout 1 1 tro/ kg 100 0 Variété X 41
mg /ml 0. 000 -0. 500 -0. 600 de Guelma -0. 400 Faible teneur en polyphénols Azeradj (26) Rougette de Mitidja (25) Souidi (24) Aimel (23) variété X (22) Aberkane (21) Chemlal (20) Sigoise (19) Tabelout (18) Azeradj (17) Bouchouk Sidi-Aich (16) Takesrit (15) Azeradj (14) Almzeir (13) Zeletni (12) Chemlal (11) Chemlal (10) Bouchouk (9) Bouchouk Guergour (8) Takesrit (7) Tabelout (6) Limli (5) Blanquette de Guelma (4) Limli(3) Agrarez (2) Bouichret (1) Activité antiradicalaire contre le radical DPPH (IC 50) Tabelout Blanquette Variété X -0. 10050 IC ≤ 0, 060 -0. 200 mg/ml -0. 300 IC 50 ≤ 0, 57 mg/ml 42
Evaluation de l’activité antimicrobienne 43
Évaluation de l’activité antimicrobienne Evaluation activité antimicrobienne Quinze échantillons Huiles d’olives 1 2 4 5 9 10 12 Extraits phénoliques Cultivar (cv. ) Tocophérols 14 Azeradj Bouichret 15 Takesrit Agrarez 18 Tabelout Blanquette de Guelma 19 Sigoise Limli 21 Aberkane Bouchouk 22 Variété X Chemlal 23 Aimel Zeletni 24 Souidi 44
Souches cibles Bactéries Gram + • Salmonella typhi ATCC 14028 • Bacillus subtilis ATCC 6633 • Staphylococcus Aureus Résistant à la Méthicilline ATCC 43300 • Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bactéries Gram - • Escherichia coli ATCC 25922 • Vibrio cholerea ATCC 14035 • Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Levure • Candida albicans ATCC 10231 45
Évaluation de l’activité antimicrobienne des huiles d’olives Medina et al. (2006) 2 ml de solution PBST Dénombrement des colonies Incubation à 37°C pendant 24 h Incubation à 37°C/1 h sur une plaque agitatrice 200 µl de chaque souche 107 1 ml 100 µl d’huile d’olive 10 -6 10 -2 1 ml 10 -1 (Échantillon) 46
Figure 12: Activité des huiles vis-à-vis des bactéries V. Cholerea Gram (-) Plus S. typhi < de 50% d’inhibition 6 résistante Inhibition de 10 au bout 1 h incubation E. coli P. aeruginosa 6 Faible activité vis-a-vis des quatre souches 5 4 3 2 1 co ph ér ol 4) i ui d To (2 3) So im A X ét é ri el (2 (2 2) 1) e rk be Va an e A Si go is t lo u be Ta (2 9) (1 8) (1 (1 t sr i ke Ta ze ra dj (1 5) 4) 2) (1 A tn i le Ze la l m Ch e uk ho (1 (9 0) ) ) uc Bo Li m li (4 a el m Gu de te (5 ) ) (2 ar az gr A an qu et Tocophérols Bl Bo ui ch re t (1 ) 0 47
tt e an qu e Bl Tocophérols el ol ér ph 4) (2 3) (2 2) bout 1 h incubation To co id i So u im A 3 (2 (2 1) 4 X e 9) (1 8) (1 5) (1 4) (1 2) (1 0) (1 (9 ) ) (5 ) (4 ) (2 ) (1 5 ét é ri Va an e oi s rk be A Si g ut it sr lo Ta be Ta ke ra dj ze A ni la l Ze le t em Ch li ou k uc h Li m a az Gu el m Bo de ar gr A et hr ui c Bo Figure 13: Activité des huiles vis-à-vis des bactéries B. subtilis Gram (+) 6 Inhibition de 10 au SARM S. aureus 6 Faible activité dépasse pas 2 log 2 1 0 48
Tableau 5: Évaluation de l'activité antimicrobienne (Log N 0/N 1) des huiles d’olives différentes variétés Cultivar (cv) Bouichret (1) Bouichret Agraraz (2) Variété de huile d’olive Blanquette dede Guelma (4) Guelma Limli (5) Bouchouk (9) Bouchouk Chemlal (10) Zeletni (12) Zeletni Azeradj (14) Takesrit (15) Tabelout (18) Sigoise (19) Sigoise Aberkane (21) Aberkane Variété X (22) Variété X Aimel (23) Souidi (24) Tocophérol B. subtilis SARM S. aureus 2, 070 2, 010 >5, 800 2, 165 >6 > 6 >5, 800 2, 005 2, 036 >6 1, 985 2, 110 >6 >6 1, 090 2, 000 >6 2, 115 2, 100 1, 455 1, 785 2, 130 2, 37 >5, 800 1, 79 >5, 800 2, 060 1, 280 >5, 800 2, 100 >5, 800 1, 600 Souche cible V. cholerea S. Typhi E. coli P. C. aeruginosa C. albicans >6 2, 300 2, 305 1, 380 >5, 660 1, 405 1, 355 >5, 170 1, 185 >6 >6 2, 900 >5, 660 >6 2, 95 2, 235 1, 364 >6 2, 385 2, 435 >6 >6 1, 115 >6 >6 2, 036 >6 1, 513± >6 2, 260 1, 823 2, 090 >6 2, 120 >6 1, 868 2, 393 >6 >6 >6 1, 354 2, 435 2, 465 2, 400 2, 395 2, 375 2, 235 2, 435 1, 565 2, 370 2, 350 2, 300 2, 405 2, 120 >5, 660 2, 900 >5, 660 1, 090 >5, 660 2, 463 >5, 660 2, 023 2, 165 2, 385 1, 400 2, 085 1, 970 >6 2, 065 1, 275 1, 393 >6 1, 485 >6 1, 600 1, 493 >5, 170 2, 21 >5, 170 1, 96 2, 47 1, 710 0, 830 >5, 170 2, 96 1, 333 1, 760 49 1, 523 albicans L'activité antimicrobienne de huile d’olive
Évaluation de l'activité antimicrobienne (Log N 0/N 1) des huiles d’olives différentes variétés La relation: structure des acides gras et activité antimicrobienne n'est pas claire, Composés phénoliques Le nombre des doubles liaisons et leurs positions Composés renforce cette activité Acides gras volatils Huile d’olive 50
Étude de l’évolution de la croissance de SARM et C. albicans en présence des huiles d'olives extra vierge 2 ml de solution PBST Incubation à 37°C/15 min 200 µl de chaque souche 107 50 et 100 µl d’huile d’olive Incubation à 37°C/30 min Incubation à 37°C/45 min Incubation à 37°C/60 min 51
Étude de l’évolution de la croissance de SARM et C. albicans en présence des huiles d'olives extra vierge 7 C. albicans et 100 μl HO C. albicans et 50 μl HO SARM et 100 μl HO SARM et 50 μl HO Témoin C. albicans Témoin SARM Log UFC/m. L 6 5 4 3 2 Azeradj 1 0 0 45 60 Type de variété Souche cible 6 Log UFC/m. L 5 4 3 2 Variété X 1 5 4 3 1 0 6 Blanquette de Guelma 2 0 15 30 45 60 Temps incubation (min) 5 4 3 2 Tabelout 1 0 0 7 Volume de huile 7 Log UFC/m. L 7 6 0 7 15 30 45 0 7 60 Temps incubation (min) 6 6 5 5 5 Log UFC/m. L 6 4 3 2 Bouichret 1 Log UFC/m. L 30 Temps incubation (min) 7 Log UFC/m. L 15 4 3 2 Chemlal 1 0 15 30 45 Temps incubation (min) 60 30 45 4 3 2 Takesrit 0 0 15 30 45 Temps incubation (min) 60 60 Temps incubation (min) 1 0 0 15 30 Temps incubation (min) 45 52 60
C. albicans et 100 μl HO C. albicans et 50 μl HO SARM et 100 μl HO SARM et 50 μl HO Témoin C. albicans Témoin SARM 53
Étude de l’évolution de la croissance de SARM et C. albicans en présence des huiles d'olives extra vierge C. albicans et 100 μl HO C. albicans et 50 μl HO SARM et 100 μl HO SARM et 50 μl HO Témoin C. albicans Témoin SARM A 100μl Inhibition de la croissance du SARM au bout de 45 min Sensible SARM 7 C. albicans 7 6 6 5 5 Log UFC/m. L Inhibition de la croissance du C. albicans au bout de 60 min A 50 et 100μl 4 3 Ciafardini et Zull, Blanquette de (2015) Guelma 2 1 15 3 Hydrolyse des Bouichret triacylglycerols par les lipases 2 1 0 0 4 30 Temps incubation (min) 45 60 0 0 15 30 45 60 Temps incubation (min) 54
Évaluation de l’activité antimicrobienne des extraits phénoliques Evaluation activité antimicrobienne Diffusion sur milieu gélosé Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) 55
Tableau 6: Évaluation de l’activité antimicrobienne des extraits phénoliques Cultivar B. subtilis SARM S. aureus Gram - 14, 15 8 Bouichret (1) 11 Agraraz (2) 11 10, 75 16, 47 11, 79 9, 5 10 8, 26 8 7, 5 Blanquette dede Guelma (4) Guelma Limli (5) Bouchouk (9) S. typhi Gram + C. albicans 13 8, 87 21, 5 12, 1 9, 61 17 6 11 9, 97 22, 15 10, 27 14 7, 84 18, 5 15, 39 10, 48 14, 42 8, 575 9, 15 18, 5 14, 5 6 13, 73 15 13 11 10 10, 5 8, 01 7, 31 9, 265 9, 81 8, 74 16, 81 V. cholerea 10, 44 P. V. aeruginosa cholerea E. coli 11, 54 Zelteni (12) 19, 87 10, 04 20, 04 9, 38 9, 83 Azeradj(14) 9, 39 7, 01 13, 12 7, 75 14, 5 6 12, 00 7, 23 Takesrit (15) 16± 0 16, 04 20, 13 18, 08 17, 5 9, 23 17, 5 12, 5 Tabelout (18) Tabelout Sigoise (19) 14, 5 11, 66 7, 36 20, 93 13, 62 11, 25 10, 53 14, 5 13, 5 10, 10 9, 43 20, 5 15, 25 15 9 Aberkane (21) 11 10, 28 13, 71 10, 15 16 8, 485 18, 5 9, 5 Variété X (22) Aimel (23) 13 11, 5 14, 5 9 20, 02 17, 08 11, 76 8, 92 17, 5 9, 33 9, 37 8, 4 22 13 12 12 14, 62 7, 03 20, 86 7, 93 6, 83 8, 24 8, 72 Souidi (24) 9, 61 S. 12 aureus 7, 20 Chemlal (10) / / 56 8, 27
Tableau 7: Concentrations minimales inhibitrices (CMI) des extraits méthanoliques différentes variétés d’huiles d’olives SARM Bouichret (1) Agrarez (2) Blanquette de Guelma (4) Limli (5) Bouchouk (9) Chemlal (10) Zeletni (12) NT 1 + 1 + 2 + 1 + Azeradj (14) NT Takesrit (15) 0, 125 +++ Tabelout (18) NT Sigoise (19) Aberkane (21) Variété X (22) Aimel (23) Souidi (24) 2 + 0, 25 +++ 2 + NT S. aureus S. Typhi 0, 5 ++ 0, 25 +++ 0, 5 ++ 1 + 0, 5 ++ 0, 25 +++ 1 + 1 + 2 + 0, 5 ++ 1 + 0, 5 ++ >4 + 0, 25 +++ 1 + 0, 5 ++ NT 0, 25 +++ 1 + 0, 5 ++ 1 + >4 + NT B. subtilis P. aeruginosa C. albicans V. cholerea 0, 5 ++ 2 + 0, 25 +++ 1 + 0, 5 ++ 1 + 0, 25 +++ 2 + 1 + 0, 5 ++ 4 + 0, 5 ++ 1 + 2 + 1 + NT NT 4 + >4 + 4 + 1 + 1 + <0, 0625 +++ 0, 5 ++ 1 + 0, 5 ++ <0, 0625 +++ 0, 25 +++ 2 + 1 + 4 + 4 + 0, 25 +++ 4 + 1 + <0, 0625 +++ 1 + 0, 25 +++ NT NT NT 4 + NT E. coli 0, 5 ++ 1 + <0, 0625 +++ 0, 125 +++ 1 + 0, 25 +++ 0, 125 +++ <0, 0625 +++ 2 + 0, 5 ++ <0, 0625 +++ 0, 5 ++ 57 0, 5 ++
Activité antimicrobienne des extraits phénoliques Blanquette de Guelma Tabelout Plus riche en polyphenols Variété X Takesrit Activités les plus prépondérantes Ø La forme dialdéhydique du décarboxymethyl oleuropéine, Ø Ligstroside aglycone, Ø hydroxytyrosol 58
% élevé en acide 1 HRMN oléique (58, 21% et 76, 82%) Objectif la contribution à la détermination de l'origine géographique Acides gras Tocophérols Régions humides ou sub-humides • Riches • en composés Dérivés monoaldéhydique d'oleuro et ligs Teneurs en αd'oleuropéine et • Les acides tocophérol ligstroside secoi (≥ à 100 -1 >200 mg kg-1) ü Effet variétal ü Sites de collecte Composés Riches en des olives dialdéhydique phénoliques (conditions, d'oleuropéine environnementale, et ligstroside climat, altitude). Régions subarides 59
Variété x (22) Blanquette de Guelma (4) Tabelout (18) Ø totaux ü Poly Stabilité oxydative Takesrit (15) ØOrtho-diphe (Dérivés d'oleuro et üActivité hydroxy) antioxydante (pouvoir reducteur, DPPH) 60
P. aeruginosa plus résistante Souche cible Variété Blanquette Aberkane (21), de Guelma Bouichret (4) (1), Zeletni (12) et Variété Bouchouk x (22) (9) Hausse d'activité en passant de 50 à 100μl Volume de l’huile Activité antimicrobienne Temps de contact Augmente de 15, 30, 45 et 60 min 61
Perspectives -Elargir l'étude à d’autres variétés et à d'autres régions d'Algérie; -Approfondir l’étude des activités en faisant appel aux tests in vivo pour une meilleure évaluation de ces activités biologiques ; -Une caractérisation sensorielle des différentes variétés -Faire appel à l’analyse moléculaire qui fournira un bon outil d’identification variétal ; - Mettre sur le marché des AOP (appellation d’origine protégée) pour l’huile d’olive algérienne. - Procéder au fractionnement des extraits phénoliques et tester les activités biologique 62
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Remerciements Pr TAMANDJARI. , Directeur de thèse Pr RANDAZZO. A. , Pr TENORE. Nunzia, Jussara, Bruno département pharmacie de l’Université de Naples Federico II (Italie). Pr Rovellini, du Centre de Recherche de l’Industrie de Milan (Italie) Institue Technique d’Arboriculture Fruitière et de la vigne (ITAFV) de Takeriet (Bejaia) Le personnel ATS et Enseignants de l’UAMB et le Pr ATMANI Dj. , Doyen de la Faculté des Sciences de la Nature et de la vie de l’UAMB Le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique 64
Merci pour votre attention 65
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