SLOENO BOJENJE PO GRAMU Marijan Mateji SLOENO BOJANJE

SLOŽENO BOJENJE PO GRAMU Marijan Matejčić

SLOŽENO BOJANJE PO GRAMU, MIKROSKOPIRANJE • Ponavljanje: Na prošlim vježbama iz Uvoda u laboratorijski rad pretočili smo teorijsko znanje o mikroskopu i postupku mikroskopiranja u praksu te smo svi pojedinačno mikroskopirali mikroskopske preparate koje smo pripremili. izrađivali smo nativni (neobojeni) i jednostavno obojeni mikroskopski preparat pekarskog kvasca (Saharomices cerevisiae) po obojen po Löffleru. • Nativni preparat smo napravili tako da smo na sredinu predmetnog stakalca stavili kap fiziološke otopine te nakon što smo sterilizirali mikrobiološku ezu u plamenu plamenika, nakon što se je ohladila uzeli uzorak kvasca tako da smo zagrebli sa ezom po površini, te smo subjektivno procijenili koliko je kvasca dovoljno. kvasac smo sa ezom prenesli na predmetno stakalce te laganim kružnim pokretima umutili u kapljici fiziološke otopine da dobijemo homogenu smjesu bez grudica (većih nakupina kvaščevih gljivica). na preparat smo stavili pokrovno stakalce.

IZRADA NATIVNOG PREPARATA SA KVAŠČEVIM GLJIVICAMA

MIKROSKOPIRANJE • Preparat smo stavili na stolić od mikroskopa, uključili mikroskop i proučili izgled na najmanjem povećanju od 40 x. nakon što smo izoštrili i pogledali sliku pod 40 x povećanjem okrenuli smo revolver na srednje povećanje sa drugim objektivom koji sa okularom daje 10 puta veće povećanje, dakle, promatrali smo nativni preparat kvaščevih gljivica na povećanju od 400 x. to je bilo ujedno i najveće povećanje jer nativne preparate ne možemo promatrati sa imerzijskim objektivom koji zahtjeva upotrebu imerzijskog ulja. vidjeli smo da sve stanice nisu jednake veličine i da se neke stanice spremaju za diobu tzv. pupanje – način na koji se stanice kvasca razmnožavaju. • nativni preparat ima kratki vijek za upotrebu ali nam zato može dati specifične informacije o kretanju nekih mikroorganizama poput parazita koje onda na taj način možemo prepoznati i indentificirati te potvrditi njihovu prisutnost.

• BOJANJE PO LÖFFLERU Na sredinu predmetnog stakalca kapnemo kap fiziološke otopine, steriliziramo ezu te uzmemo uzorak kvasca i razvlačimo preparat u obliku elipse do dvije trećine stakalca bez da preparat dođe blizu bočnih rubova. pustimo preparat da se osuši na zraku, kada je preparat suh grafitnom olovkom napisemo broj protokola ili svoje ime i prezime te ga sa za kraj stakalca uhvatimo sa drvenom štipaljkom i tri puta pod kutem od 45⁰ prođemo kroz plamenika te smo tim fizikalnim postupkom fiksirali preparat za podlogu (predmetno stakalce). stavimo preparate na kadicu na mostić jedan uz drugoga da potrošimo manje boje i prelijemo metilenskim modrilom te nakon 3 minute isperemo sa destiliranom vodom, obrišemo donji dio stakalca i rubove sa staničevinom te pustimo da se preparat osuši. mikroskopiramo sa imerzijskim objektivom od 1000 x.

Razmazivanje preparata u kapi 0. 9 % Na. Cl Sušenje razmaza na zraku Fiksiranje preparata prolaskom 3 puta prolaskom kroz plamen 3 minutno bojanje, ispiranje, sušenje, i mikroskopiranje pod povećanjem 1000 x uz imerziju Mikroskopiranje Gljivice obojane Metilenskim modrilom pod mikroskopskim povećanjem od 1000 x uz imerziju

UZORKOVANJE BRISA BUKALNE SLUZNICE • Uzmemo sterilni brisni štapić, kažemo osobi da otvori usta i drži ih otvorenima tijekom uzimanja uzorka te sa brisnim štapićem prolazimo više puta sluznicu usne šupljine (samo uzorkovanje nije neugodno niti bolno za pacijenta). Nakon što smo subjektivno zaključili da imamo dovoljnu količinu uzorka na brisnom štapiću nasadimo ga na diferencijalnu hranjivu podlogu poput krvnog agra sa štapićem te stavimo na inkubaciju a sa istim štapićem napravimo bris na stakalcu na potpuno isti način kako smo sa ezom razmazali kvaščeve gljivice pri jednostavnom bojenju, međutim, bez dodavanja fiziološke otopine. Pustimo preparat da se osuši, prođemo sa njim 3 puta kroz plamenika da fiksiramo uzorak te ga stavimo na mostić da bi ga mogli obojiti po Gramu.

SLOŽENO BOJENJE BRISA BUKALNE SLUZNICE PO GRAMU • Gram+ bacili Za razliku od jednostavnih bojenja, složena bojenja su diferencijalna jer imamo različite boje koje različito boje pojedine djelove stanica i stanične pozadine. imamo kisele i bazične boje kisele djelove stanice kao što su npr. stanične jezgre jer je dna kiselina pa su jezgre stanica obično obojene plavoljubičasto, dok ne neki drugi organeli i dijelovi stanice i citoplazme boje kiselim bojama. bojenje po gramu je prvi opisao danski biolog Christian Gram 1884. , bojenje je prošlo različite modifikacije ali je zadržalo ime osobe koja ga je prva opisala. važno je u indentifikacija bakterija na gram+ i gram- bakterije, u praksi pomaže u odabiru pravog dezinficijensa i u odabiru djelotvornog antibiotika uz specifičnije metode. ü gram negativne bakterije su crvene boje ü gram pozitivne bakterije su plave boje Gram- bacili

1. Nanosimo prvu boju KRISTAL VIOLET i ostavimo 4 minute 2. Prelijemo LUGOLOVOM OTOPINOM da bi fiksirali prvu boju 12 minute 3. preparat se dobro ispere sa 96 % etanolom sve dok ne teče etanol prozirne boje što znači da smo maknuli višak prve boje i lugola sa stanica koje nisu reagirale s tim bojama gram- BOJANJE PO GRAMU 4. djelovanje etanola prekida se ispiranje vodovodnom vodom da i gram+ bakterije ne izbijede 5. nanosimo KARBOL FUKSIN i ostavimo 30 -60 sekundi 6. dobro isperemo vodom da se višak KARBOL FUKSINA ukloni 7. pustimo preparat da se osuši te ga mikroskopiramo pod imerzijskim objektivom sa kapi imerzijskog ulja. Usna šupljina ima bogati mikrobiom, na zubima postoji posebno razvijen biofilm određenih bakterijskih vrsta a na bukalnoj sluznici prevladava rod Streptococcus spp.

Kristal violet Lugolova otopina Etilni alkohol Karbol fucsin Kristal violet Lugolova otopina 96 % etilni alkohol Karbol fuksin

PRIMJERI – UZORCI POD MIKROSKOPOM Streptococcus viridans Pločaste epitelne stanice i pokoji kok Streptococcus mutans

üSložena ZAKLJUČAK bojanja nam služe u razlikovanju bakterija, gljivica, plijesni, promatranju i izučavanju njihove morfologije kako bi ih mogli lakše prepoznati u rutinskom radu i olakšati mikrobiološku dijagnostiku da s razlogom sumnjamo na uži broj uzročnika upale i oštećenja kada znamo uzorak kojeg tkiva promatramo i koje bakterije se najčešće natječu i dospijevaju do tog područja te u određenim uvjetima oslabljenog imuniteta, manjka nutritivne gustoće hrane (manje esencijalnih tvari koje organizam treba) mogu ugroziti organizam i izazvati bolest.

PONAVLJANJE 1. 2. Kako se zove osnovno složeno bojanje? 3. Koje su glavne prednosti složenog bojanja naspram jednostavnog? 4. Kako se diferenciraju bakterije obojene po gramu i koje su boje obojane bakterije? 5. Što nam je glavni cilj u medicini na primjeru usavršavanja bojenja po danskom znanstveniku Christianu Gramu? Koje je najveće povećanje školskog mikroskopa ako je povećanje okulara 10 x a imerzijski objektiva 100 x?