Sindromi linfoproliferative croniche Caratteristiche comuni Espansione della malattia

Sindromi linfoproliferative croniche Caratteristiche comuni • Espansione della malattia più per accumulo che per attiva replicazione. • Cellule arrestate in fase G 0 del ciclo cellulare per meccanismo di inibizione dell’apoptosi. • Decorso spesso indolente. • Difficile eradicazione. • Possibilità di trasformazione verso una forma più aggressiva.

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE LEUCEMIE CRONICHE LINFOMI LEUCEMIZZATI B-LLC FOLLICOLARI B-PLL MANTELLARI HCL T-LGL NK-LGL DELLA ZONA MARGINALE

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE • Linfocitosi in presenza o meno di linfoadenomegalie, epatosplenomegalia; sviluppo di anemia, piastrinopenia, ipogamma -globulinemia, sintomi sistemici • Oggi diagnosi spesso occasionale nel 70 -80% dei casi • Diagnosi definitiva basata sulla combinazione di linfocitosi con morfologia e immunofenotipo caratterisitci

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE LINFOCITOSI LINFOADENOMEGALIA

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA ASPETTI DIAGNOSTICI LINFOCITOSI RELATIVA ASSOLUTA % dei linfociti è superiore a quella dei neutrofili Il valore assoluto dei linfociti è > 5000/ml

ASPETTI DIAGNOSTICI LINFOCITOSI REATTIVA O NEOPLASTICA? (quantità+qualità)

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA • • Linfocitosi>5 x 109 L Le linfocitosi benigne o “reattive” sono espansioni di linfociti T e B policlonali. ni oliferativi Isono maligni • caratterizzati da una proliferazione linfociti B o T monoclonali. di

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: DIAGNOSI Ø Morfologia Ø Citochimica Ø Immunofenotipo Ø Citogenetica Ø Genetica molecolare Ø Profilo genomico

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE DIAGNOSI MORFOLOGIA + IMMUNOFENOTIPO

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Leucemia Linfatica Cronica Tipica Mista

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Linfoma Follicolare

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Linfoma Mantellare

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Linfoma splenico a linfociti villosi

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ASPETTI MORFOLOGICI Leucemia a prolinfociti

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO Ø Definizione diagnostica Ø Identificazione di fattori prognostici Ø Identificazione di sottotipi a diversa prognosi Ø Identificazione della malattia minima residua

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO Accessibilità delle cellule neoplastiche + Disponibilità di Ac. Mo + “Stabilità fenotipica” IDENTIFICAZIONE DI PATTERN CARATTERISTICI

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO ANTIGENI LEUCOCITARI E NOMENCLATURA CD ANTICORPI MONOCLONALI CONTRO ANTIGENI LEUCOCITARI RAGGRUPPATI IN BASE ALLA REATTIVITA’ CON MOLECOLE IDENTICHE • • • MARKERS DI PRECUSORI: CD 90, CD 133, CD 34 MARKERS DI LINFOCIT B: CD 19, CD 20, CD 79, CD 10 MARKERS DI LINFOCITI T: CD 2. D 7, CD 3, CD 4 , CD 8 MARKERS DI CELLULE NK: CD 7, CD 56, CD 57, CD 158 MARKERS NON RISTRETTI A UNA LINEA DI DIFFERENZIAZIONE: CD 11 b, CD 11 c, CD 25, CD 38, CD 27

IMMUNOFENOTIPO Identificazione di una popolazione cellulare un tessuto (biopsia)

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO Possibilita’ di studiare sangue intero (periferico e/o midollo) Sviluppo di strategie di analisi multiparametriche per meglio identificare la popolazione da analizzare Possibilita’ di impiegare reagenti e tecniche di permeabilizzazione della cellula Sviluppo di tecniche per la quantificazione dell’espressione antigenica

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO METODI DI ANALISI APPROCCIO MULTIPARAMETRICO (FSCvs. SSC, FSCvs. FL, SSCvs. FL, FLvs. FL) DETERMINAZIONE QUANTITATIVA (% cellule positive) DETERMINAZIONE QUALITATIVA (MESF, MFI)

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO NON PUO’ PRESCINDERE DALLA CONOSCENZA DELLE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE

NORMALE LLC LNH NORMALE LNH HC

FREQUENZA RELATIVE DELLE DIVERSE POPOLAZIONI NEL SANGUE PERIFERICO E NEI TESSUTI LINFOIDI (%) SANGUE PERIFERICO INFANZIA B-LIN CD 3+ CD 4+ CD 8+ NK 2 -5 aa 5 -15 aa 24 64 37 24 10 17 68 38 26 13 LN TONSILLE MILZA 41 56 48 10 1 51 49 42 6 <1 55 31 17 14 15 ADULTO 12 72 44 24 13

NEOPLASIE EMATOLOGICHE METODI DI ANALISI APPROCCIO MULTIPARAMETRICO R 5 R 3 R 4 R 2 R 1

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE B-LLC B-PLL HCL MCL FL SLVL Sm. Ig ± +++ ++ ++ CD 19 ++ ++ ++ CD 5 + - - CD 20 ± + +++ ++ CD 23 CD 11 c + - - ++ - ± - - FMC 7 ± +++ ++ - +++ CD 25 + - +++ - - +

NORMAL PERIPHERAL AND BONE MARROW B CELL SUBSETS: % OF B CELLS

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE I marcatori espressi dal linfocito B neoplastico sono molteplici e “l’importanza” di ciascuno di essi è diversa. Tuttavia, la diagnosi immunofenotipica di malattia linfoproliferativa cronica B può essere posta solo in presenza di restrizione clonale k o l delle catene leggere delle immunoglobuline !!!!!!!

LINFOCITOSI B MONOCLONALI MLUS O CLUS NEL SANGUE PERIFERICO<5 X 109/L 1. KAPPA: LAMBDA >3: 1 O <0. 3: 1 2. 25% DELLE CELLULE NON ESPRIMONO O ESPRMONO A BASSA INTENSITA’ s. IG 3. IMMUNOFENTOTIPO SOVRAPPONIBILE A QUELLO DELLE PIU’ COMUNI SLC (CD 5+/CD 23+; CD 5+/CD 23 -; CD 5 -) 4. LINFOCITOSI STABILI PER ALMENO 3 MESI 5. OBIETTIVITA’ NEGATIVA 6. POPOLAZIONI LINFOCITARIE CON FENOTIPO DA SLC MA CHE NON ESPRIMONO CATENE LEGGERE

Incidentally Identified Minute Clonal B-Lymphocyte Populations in Peripheral Blood and Bone Marrow

Clonal B cells (orange) in bone marrow with an immunophenotype characteristic of chronic lymphocyticleukemia

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE T: IMMUNOFENOTIPO FEATURE MORPHOLOGY PHENOTYPE T-PLL prolymphocyte LGL Leukemia Sezary Syndrome ATLL large granular lymphocytes cerebriform flower cell CD 4+/CD 8 - CD 4 -/CD 8+ CD 4+/CD 8+ NK markers+ CD 7+ CD 4+/CD 8 -

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE T: IMMUNOFENOTIPO • ISOFORME CD 45 • ISOFORME CD 158 • COME SURROGATI DI MONOCLONALITA’

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE T: IMMUNOFENOTIPO For T cell or NK cell malignancies, there is no convenient clonal marker that can be demonstrated by cell surface marker studies, although in many cases the finding of an abnormal T cell phenotype is strong evidence for a T cell malignancy. To prove clonality for T cell malignancies, gene rearrangement studies need to be performed

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE INTENSITA’ DI ESPRESSIONE ANTIGENICA MFI= INDICE MEDIO DI FLUORESCENZA Intensità media M 1 Intensità media M 2 CTR Sm. Ig M 1 MFI: intensità media M 2 intensità media M 1 M 2

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE ESPRESSIONE ANTIGENICA MFI B-Nor. B-LLC B-PLL HCL MCL FL Sm. Ig 176 35 970 176 222 266 CD 5 60 141 // // 94 // CD 23 38 53 // // // 33 FMC 7 62 11 63 67 69 // CD 20 333 121 // 953 395 637 CD 11 c 62 30 378 325 // //

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE LLC

LLC IMMUNOFENOTIPO: Linfociti B monoclonali CD 5+, CD 23+e Sm. Ig a bassa intensità. CD 19 k a p p a C D 5 CARATTERISTICO IN TUTTI GLI STADI Sm. Ig CD 23

IMMUNOFENOTIPO E PROGRESSIONE: LLC IN PROGRESSIONE MORFOLOGIA

LLC IN PROGRESSIONE IMMUNOFENOTIPO C D 5 CD 19 C D 2 3 C D 2 0 S m I g

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: IMMUNOFENOTIPI ABERRANTI • • • ASINCRONIA DI ESPRESSIONE ABERRANTE VARIAZIONI DELLE CARATTERISTICHE FISICHE MALATTIA MINIMA RESIDUA

ESPRESSIONE ABERRANTE DI CD 22 NELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE A BASSO GRADO LN NORMALE MCL BM NORMALE L LINFOPLASMOCITICO L ZONA MARGINALE FCL LLC HCL

MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE MALATTIA MINIMA RESIDUA Approccio analitico multiparametrico Utilizzo di più combinazioni di marcatori Determinazione espressione antigenica più appropriata Determinazione della distribuzione delle catene leggere delle Ig

C D 5 CD 19 Determinazione selettiva delle catene leggere Ig mediante tripla marcatura sui linfociti CD 19 positivi Gate CD 19 R 1 k a p p a

C D 5 Determinazione selettiva delle catene leggere Ig mediante tripla marcatura sui linfociti CD 19 positivi CD 19 Gate CD 19 R 1 k a p p a lambda

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI ESPRESSIONE CD 38 > 30% ESPRESSIONE ZAP 70 > 20% ASSENZA MUTAZIONI GENI Ig RAPIDA PROGRESSIONE RIDOTTA SOPRAVVIVENZA

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI C D 3 8 CD 19 Espressione stabile correlata a malattia a intermedio-alto rischio Antigene a significato prognostico negativo Ematologia-Siena

COSA E’ ZAP-70?

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI C D 38 ZAP-70 GUIPAUD, THE LANCET ONCOLOGY, 2003

S S C R 1 R 1 FSC C D 5 CD 19 Ematologia-Siena

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI C D 38 ZAP-70 GUIPAUD, THE LANCET ONCOLOGY, 2003

IMMUNOFENOTIPO IN EMATOLOGIA IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI C D 3 8 CD 19 Espressione stabile correlata a malattia a intermedio-alto rischio Antigene a significato prognostico negativo Ematologia-Siena

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: IMMUNOFENOTIPO E PROGNOSI CICLINE

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: BIOPSIA LINFONODALE • AGOBIOPSIA • BIOPSIA CHIRURGICA

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHEAGOBIOPSIA + FCM

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: BIOPSIA CHIRURGICA MCL BC L -1 Naive B cells ? Plasmacells BCL-6 CD 5+ Memory B cells p 53 Transformed p 16 DLCL 5 XPA 2 LC B FL P A Germinal center Ig mutations B-CLL/SLL LT /M 2 I Marginal zone Mantle MALTL LPL

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: ASPIRATO E BIOPSIA MIDOLLARE Aspirato e biopsia midollare: midollare • non essenziali per la diagnosi ma utili in caso di morfologia atipica (es. LLC se presenza di centri di proliferazione e assenza di foci paratrabecolari) • Monitoraggio effetto terapeutico (MMR)

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: GENETICA • • • CITOGENETICA CONVENZIONALE FISH GENETICA MOLECOLARE GENOMICA PROTEOMICA

Incidenza di anomalie citogenetiche in pazienti con LLC Anomalie citogenetiche si riscontrano in circa l’ 80% dei pazienti con LLC (FISH) Dohner et al, NEJM 2000

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: GENETICA MOLECOLARE MCL BC L -1 Naive B cells ? Plasmacells BCL-6 CD 5+ Memory B cells p 53 Transformed p 16 DLCL 5 XPA 2 LC B FL P A Germinal center Ig mutations B-CLL/SLL LT /M 2 I Marginal zone Mantle MALTL LPL

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: GENOMICA

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE: PROTEOMICA IPERPLASIA REATTIVA LINFOMA B

SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE CRONICHE CRITERI DIAGNOSTICI 4 MORFOLOGICI 4 IMMUNOFENOTIPICI 4 CITOGENETICI 4 MOLECOLARI 4 CLINICO-LABORATORISTICI