Sindrome di Myhre Bassa statura Rigidit articolare Ipertrofia

Sindrome di Myhre Bassa statura Rigidità articolare Ipertrofia muscolare generalizzata Serie riconoscibile di caratteristiche facciali: (fessure palpebrali corte, ipoplasia della parte mediana della faccia, bocca piccola con un sottile labbro superiore, prognatismo) Anomalie scheletriche: (ossa del cranio spesse, platispondilia, coste allargate, ali iliache ipoplastiche e brachidattilia) Deficit cognitivi variabili Numero di casi annotati <30 Eredità autosomica dominante per insorgenza de novo? Caratteristiche cliniche di pazienti rappresentativi affetti da sindrome di Myhre

Scopo del lavoro 1. Identificazione dell’evento molecolare responsabile della sindrome 2. Valutazione dell’origine parentale della mutazione Obiettivi della tesi.

Passi sperimentali 1 • Estrazione del DNA 2 • Sequenziamento dell’esoma di un singolo paziente 3 • Filtraggio delle varianti 4 • Prioritizzazione delle varianti 5 • Validazione delle varianti 6 • Conferma della mutazione nel probando e in altri 7 affetti 7 • Ricerca di famiglie informative 8 • Analisi degli aplotipi Diagramma di flusso della procedura sperimentale utilizzata.

Composizione del campione di studio 8 soggetti con caratteristiche cliniche coerenti con la MS e i loro genitori La raccolta e l’archiviazione del materiale biologico sono state possibili grazie alla collaborazione con i centri di provenienza dei campioni: - Ospedale “Bambino Gesù” (Roma), Prof. Dallapiccola - Università di Torino, Prof. ssa Silengo - Arcispedale Santa Maria Nuova (Reggio Emilia), Dott. ssa Garavelli - Ospedale Microcitemico (Cagliari), Dott. ssa Boccone - Università “Federico II” (Napoli), Dott. ssa Melis

Sequenziamento dell’esoma Due sequenziamenti separati di un singolo paziente affetto Genome sequencer 454 GS FLX Titanium (Roche), Istituto Superiore di Sanità, Reparto di fisiopatologia delle malattie genetiche Cattura dell’esoma mediante Sequence Capture Human Exome 2. 1 M Array v. 2 (Nimblegen) 1. Preparazione della libreria di sst. DNA 2. Cattura dell’esoma 3. Processamento della libreria Flusso di lavoro del sequenziatore 454 (Roche). 4. Sequenziamento della libreria 5. Analisi dei dati ottenuti

Risultati del sequenziamento Lunghezza media delle read: 380 bp Copertura delle sequenze bersaglio: 98% Profondità media di sequenza: 10 x Assemblaggio Mappatura Analisi delle varianti Fluogramma prodotto dal software del sequenziatore. I fluogrammi provenienti da ogni pozzetto della piastra PTP vengono interpretati, ottenendo così le reads che verranno mappate sul genoma di riferimento al fine di individuare le zone di identità e le posizioni varianti.

Filtraggio delle varianti All. Diffs 133. 889 BEDTools GSMapper HCDiffs 72. 426 varianti 665 nuove varianti codificanti db. SNP Uniprot, Hap. Map BLAST 185 varianti non sinonime 18 varianti di splicing Progressiva riduzione delle varianti prodotte dal sequenziamento dell’esoma ottenuta attraverso l’applicazione sequenziale dei diversi tools informatici.

Prioritizzazione delle varianti filtrate Due approcci 203 varianti Metodo “soggettivo” Sostituzion e deleteria SIFT Poly. Phen -2 Varianti causali candidat e Metodo. Varianti “oggettivo” causali DAVID candidat Génie e DAVID Génie PITX 2 CRB 1 SMAD 4 EFHC 1 THBS 3 HSPG 2 TGFβ Parole chiave Bassa statura Rigidità articolare Ipertrofia muscolare Brachidattilia ADAMTS 3 Sordità PAPLN HKR 1 Ritardo mentale DUSP 16 MYH 2 BRD 7 ARHGAP 5 PKD 2 SNX 10 HAS 3 PITX 2 GLI 1 PP 3 CA SETX Rappresentazione schematica della scelta delle varianti da validare effettuata attraverso approccio soggettivo ed oggettivo. MRE 11 A SMAD 4

Validazione delle varianti selezionate Le regioni codificanti colpite dalle mutazioni selezionate sono state confermate nel paziente e poi verificate nei genitori tramite sequenziamento con metodo di Sanger. Validazioni metodo “soggettivo” Gene ADAMTS 3 PAPLN HKR 1 DUSP 16 BRD 7 ARHGAP 5 SNX 10 HAS 3 GLI 1 PP 3 CA Esone 13 9 4 6 12 1 11 3 Sostituzione amminoacidica N 585 S R 365* R 532* R 398 C S 462 G C 455 Y Y 29* A 93 T R 1068 W R 112 C Validazioni metodo “oggettivo” Eredità paterna materna paterna materna Gene Esone Sostituzione amminoacidica Eredità PITX 2 2 D 39 E materna SMAD 4 11 I 500 V de novo

Coinvolgimento causale del gene SMAD 4 Risultati L’esone 11 del gene è stato sequenziato anche a partire dai campioni di DNA estratti da altri tessuti escludendo fortemente la possibilità di un evento somatico. L’intera sequenza codificante del gene è stata sequenziata anche negli altri sette individui affetti non imparentati. Identificazione di due mutazioni de novo in eterozigosi che colpiscono il medesimo codone: c. 1498 A>G e c. 1499 T>C Elettroferogrammi che mostrano la presenza delle sostituzioni non sinonime in eterozigosi in vari tessuti di due pazienti.

Varianti identificate nel gene SMAD 4 Risultati 2 mutazioni de novo identificate nell’intera coorte (8 casi) Sostituzione del medesimo amminoacido isoleucina 500 con una valina (5 casi) o con una treonina (3 casi) Paziente Esone Mutazioni Sostituzione amminoacidica OBG_01 11 1498 A>G Ile 500 Val TO_01 11 1499 T>C Ile 500 Thr TO_02 11 1498 A>G Ile 500 Val TO_03 11 1498 A>G Ile 500 Val RE_01 11 1499 T>C Ile 500 Thr NA_01 11 1498 A>G Ile 500 Val NA_02 11 1498 A>G Ile 500 Val CA_01 11 1499 T>C Ile 500 Thr

SMAD 4 Discussione E’ un membro della famiglia di fattori di trascrizione intracellulari che operano nella via di segnalazione del TGF-β https: //en. wikipedia. org/wiki/Transforming_growth_factor_beta 3 classi: R-Smad, I-Smad e Co-Smad (SMAD 4) Due domini: MH 1 e MH 2 uniti da una regione linker Le 3 classi della famiglia di proteine Smad e i loro elementi strutturali (Massagué et al. , 2005).

Via di segnalazione del TGF-β I ligandi della superfamiglia del TGF-β iniziano la segnalazione assemblando dei complessi recettoriali che attivano i fattori trascrizionali SMAD 4 è essenziale per la formazione dei complessi trascrizionalmente attivi. La sua disregolazione è attesa avere effetti pleiotropici. Trasduzione del segnale nel pathway del TGF-β

Conservazione del residuo Ile 500 del dominio MH 2 Il residuo Ile 500 mutato nella MS ricade all’interno del dominio MH 2, il quale risulta altamente conservato tra gli ortologhi e paraloghi. Allineamento parziale della sequenza amminoacidica del dominio MH 2 di SMAD 4 (dal residuo 489 al 552) negli ortologhi. Si può notare la conservazione sia del residuo Ile 500 (freccia) che dei residui colpiti da mutazioni somatiche associate al cancro (cerchi rossi) e/o dalle lesioni germinali che ricorrono nella JPS e nella JPS-HHT (cerchi blu).

SMAD 4 oncosoppressore Mutazioni somatiche: colpito da perdita biallelica in tumori pancreatici, tumori metastatici del colon e in altri carcinomi Mutazioni germinali: nella JPS e nella JPS-HHT Nessun coinvolgimento della Ile 500 Rappresentazione schematica del gene SMAD 4. Sono mostrate le mutazioni non senso (cerchi rossi) e le delezioni (triangoli rosa) riportate nella JPS-HHT. I picchi blu indicano la distribuzione delle mutazioni somatiche ricorrenti nel cancro.

Possibili effetti promossi dalle mutazioni della MS Compromettono il legame di SMAD 4 ai suoi partner di segnalazione Impediscono la corretta ubiquitinazione sulla Lys 519 e perturbano il flusso del segnale (A) Rappresentazione della superficie accessibile al solvente del complesso formato dai domini MH 2 di SMAD 4/SMAD 3. Il monomero SMAD 4 è mostrato in azzurro, mentre le due subunità SMAD 3 sono colorate in giallo e bianco. Il residuo Ile 500 è colorato in rosso. (B) Rappresentazione dell’interazione tra la Ile 500 (rosso) e i residui circostanti. In blu: Arg 496, Arg 497, Arg 502, Glu 526, e His 528. In viola: Lys 519.

Origine parentale delle mutazioni puntiformi Il numero di divisioni cellulari necessarie per produrre gli spermatozoi è in relazione con l’età. Errori casuali di copiatura del DNA tendono ad insorgere principalmente nella linea germinale maschile. In più: ridotta fedeltà nella replicazione del DNA, inefficienza dei meccanismi di riparazione, esposizione a mutageni, possibili eventi di selezione. Divisioni delle cellule germinali nella linea maschile. S cellula staminale; G cellula gonadica; M cellula meiotica (Strachan and Read, 2006)

Ricerca di famiglie informative 10 polimorfismi intronici 5 famiglie informative Clonaggio dei pazienti Analisi degli aplotipi Esempio di famiglia informativa e aplotipi attesi tramite clonaggio di un frammento di DNA genomico del probando contenente il polimorfismo intronico informativo e la mutazione.

Origine paterna della mutazione Genotipo SNP Padre Madre Caso Aplotipo su cui risiede la mutazione Origine T/C 1498 G, 1447+257 C paterna C/C T/C 1498 G, 1447+257 T paterna T/T T/C 1498 G, 1447+257 C paterna 1499 C, 1447+610 T paterna 1499 C, 1659+11 C paterna Caso Mutazione SNP TO_03 1498 A>G c. 1447+257 T>C T/T NA_01 1498 A>G c. 1447+257 T>C T/T NA_02 1498 A>G c. 1447+257 T>C C/C TO_01 1499 T>C c. 1447+610 T>del. T CA_01 1499 T>C c. 1659+11 C>T T/del. T C/C Aplotipo materno (WT) C/T Aplotipo paterno (mutato) Aplotipi del probando determinati attraverso amplificazione e clonaggio della sequenza genomica comprendente il sito polimorfico e la mutazione.

Conclusioni SMAD 4 è il gene responsabile della sindrome di Myhre Un ristretto spettro di mutazioni de novo, non sinonime ed eterozigoti di SMAD 4 sono state identificate in tutti i soggetti affetti da MS inclusi nello studio: disordine geneticamente omogeneo fenotipo relativamente uniforme Eredità paterna in 5 casi su 5 sbilanciamento a favore dell’origine paterna osservato in molte malattie dominanti dovute a mutazioni puntiformi. Caratteristiche cliniche di pazienti con mutazioni eterozigoti in SMAD 4 (Le Goff et al. , 2012)