Sinalizao intracelular na ilhota pancretica materna durante o

Sinalização intracelular na ilhota pancreática materna durante o período perinatal Silvana Bordin Depto. De Fisiologia e Biofísica ICB - USP

Homeostase glicêmica Resitência à insulina Aumento da secreção

Alterações da secreção de insulina durante a gravidez e lactação Gravidez normal Demanda Nutricional + Hormônios Diabetogênicos Resistência periférica + secreção de insulina Hiperinsulinemia e normo- ou hipoglicemia

Diabetes Mellitus Gestacional (GDM) Resistência periférica sem compensação da resposta secretora de insulina Hiperglicemia materna + Hiperinsulinemia fetal

Adaptações da ilhota pancreática na gestação Histórico: Aumento da massa da ilhota (1930) (Akehi T. Apud Hellman B, Acta Obstr Gynec Scandinav. 39: 331 -342, 1960) Aumento da secreção de insulina (60’) (Spellacy , 1962; Malaisse ; 1969; Green & Taylor, 1972) Lactogênio Placentário & Prolactina (80’) (Nielsen, 1982; Sorenson, 1985; Boschero, 1993) Glut 2, HK, c. AMP, Ca 2+, K+, CX, etc

Vias de sinalização da Prolactina Bole-Feysot et al. Endocrine Reviews, 1998

J Endocrinol, 2004 Pregnant Control 30 Insulin secretion (ng/islet/h) S AS 20 * 10 0 basal; stimulated

Ativação das vias PI 3 K/AKT e MAPK pela PRL S Phosphorylation AS Pp 70 S 6 K Arbitrary densitometric Protein * p-AKT * control; pregnant

Aumento da secreção de insulina na gestação é dependente da ação da Prolactina PRL JAK 2 ATP STA T 5 Genes-alvo (? ) Secreção de insulina Crescimento celular Efeitos Biológicos

Mol Cell Endocrinol, 2004 Effectors & intracellular transducers PRL Cell cycle regulators MEK 2 ERK-1, -2, -3 AKT-2 AKT-1 I-kappa B LAR 14 -3 -3 zeta/delta STAT 3 Cyclins D 1, D 2 PCNA CDK 4 p 27 kip-1 EIF-2 Receptors & Transporters Exocytosis Transcription factors Synaptotagmin IV Secretogranin V CAM c-jun Ca. BP 2 Max Translation TNF-R 1 MIF BMP-R SST CD 24 ACh-R NSE Na/K ATPase Cu/Zn SOD IGF 2 -R 40 S & 60 S Ribosomal proteins (4) TRH IL 1 -R 1 IL 6 -R Others

Gestação Effectors & intracellular transducers Cell cycle regulators ERK -3 AKT -1 I-kappa B STAT 3 Cyclins D 3 PCNA Proteasome C 3 Receptors & transporters Others Exocytosis VDCC Ca. BP 2 prohormone convertase 1 PMCA Transcription factors c-jun Max c-fos Jun-D CREBP nur 77 Translation TRH CD 24 Cu/Zn SOD 40 S & 60 S Ribosomal proteins (3) GH-R IL 1 -R 1, IL 6 -R GRP-R IGF 2 -R, IGF 1 -R BMP-R ACh-R PGD 2 -R GLUR 2 & 8 GLUT-1 & 2

ERK 3 • Membro atípico da família das MAPKs • Isoformas p 97 e p 63 • Localização nuclear e citoplasmática • Função ? (ciclo celular) • Ativação ? (PKC) MAPK = Mitogen-Activated Protein Kinase Microtubule-Associated Protein Kinase

Mol Cell Endocrinol, 2006 200 Insulin # Insulin/ERK 3 # # IP: Map 2 IB: p-Ser 100 IP: Map 2 IB: Map 2 * 2. 0 0 phospho serine/Map 2 ratio CTL SO-ERK 3 ASO-ERK 3 1. 5 Glucose 5. 6 m. M 1. 0 0. 5 0. 0 Vehicle PMA CTL Vehicle PMA ASO-ERK 3 Glucose 11. 1 m. M ERK 3 participa do processo de secreção de insulina Mecanismo proposto: ativação de proteínas reguladoras do rearranjo de microtúbulos

STAT 3 • IL 6: estimula proliferação e expressão da insulina • Leptina: inibe síntese e secreção de insulina KO-STAT 3 (mamária): retarda a involução

A secreção de insulina volta aos valores normais já no terceiro dia de lactação Kawai and Kishi, 1999

Expressão e Fosforilação do STAT 3 na gestação e lactação

STAT 3 -ins. KO BBRC, 2004

Supressão da 1ª fase da secreção na lactação

Primeira fase da secreção de insulina

Expressão diminuída de SERCA 2 em ilhotas pancreáticas está associada à diminuição da oscilação de [Ca 2+]c, consumo de O 2 e secreção de insulina frente ao estímulo com glicose. Kulkarni et al. , 2004 SERCA 2 (mas não SERCA 3) está envolvida na regulação do [Ca 2+]c de repouso das células b, o que indica que SERCA 2 é a principal Ca 2+-ATPase do ER em condições fisiológicas. (Varadi & Rutter 2002).

Expressão de SERCA em ilhotas de ratas grávidas e lactantes

STAT 3 -ASO reproduz os efeitos observados em animais STAT 3 -ins. KO

STAT 3 -knockdown previne o aumento de expressão de SERCA 2 e IP 3 R induzido por PRL 1, 4 IP 3 R / RPL 37 a ratio 1, 2 1, 0 0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 0 CTL PRL ASO+ PRL

Níveis circulantes de PRL permanecem altos em ratas no início da lactação Gestação Lactação Kawai and Kishi, 1999

Dexametasona diminui os efeitos da PRL sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas de ratas Weinhaus et al. , 2000

Dexametasona modula negativamente a fosforilação em serina induzida por PRL do STAT 3 em células RINm 5 F

Dexametasona modula negativamente o efeito da PRL sobre a expressão de SERCA 2 em ilhotas pancreáticas

Conclusões • A fosforilação em serina do STAT 3 e a expressão de SERCA dois aumentam no fim da gestação e retomam valores normais já no 3º dia de lactação. • O efeito positivo da PRL sobre a expressão de SERCA 2 é dependente do STAT 3. • A DEX regula negativamente a ação da PRL sobre a fosforilação em serina do STAT 3 e expressão de SERCA 2 STAT 3 -regulated SERCA 2 expression by prolactin and glucocorticoids is involved in the adaptation of insulin secretory response during the peripartum period. Anhê GF, Nogueira TCA, Nicoletti-Carvalho JE, Lellis-Santos C, Cipolla-Neto J, Bosqueiro JR, Boschero AC, Bordin S. J. Endocrinol (submetido)

Expressão e fosforilação de proteínas da via da AKT em ilhotas pancreáticas de ratas grávidas e lactantes

Expressão e fosforilação das ERKs 1 e 2 em ilhotas pancreáticas de ratas grávidas e lactantes

Dexametasona contrapõe o efeito da PRL sobre a fosforilação de ERK 1/2

Expressão de fosfatases reguladoras das vias da AKT e ERK 1/2 em ilhotas de ratas lactantes

Expressão de fosfatases reguladoras das vias da AKT e ERK 1/2 em células RINm 5 F tratadas com DEX

Conclusão Os glicocorticóides estimulam a expressão da fosfatase MKP-1 e consequentemente regulam negativamente a fosforilação das ERK 1/2. Este mecanismo deve estar envolvido na regressão ao estado basal de ilhotas de ratas grávidas, que ocorre no início da lactação.

Laboratório de Biologia Molecular Silvana Bordin Gabriel F. Anhê José Edgar N. Carvalho Camilo de Lellis Santos Tatiane C. de Araújo Nogueira Luciana C. Caperuto Rui Curi José Cipolla Neto Carla R. O. Carvalho Andrea S. Torrão Angelo R. Carpinelli A. C. Boschero M. Esméria. C. Amaral José Roberto Bosqueiro Licio A. Velloso (11)3091 -7961 sbordin@icb. usp. br