Service de Bactriologie Dpartement des Maladies infectieuses et
Service de Bactériologie Département des Maladies infectieuses et parasitaires Faculté de Médecine Vétérinaire Cours de bactériologie 2ème doctorat Jacques Mainil Les souches entérohémorragiques d’Escherichia coli en médecine vétérinaire 1
Pathogenic strains of Escherichia coli Acronyms EHEC EPEC DHEC Ex. PEC UPEC NMEC APEC Pathotypes (or virulotypes) Enterohaemorrhagic E. coli Enteropathogenic E. coli Diarrhea-associated Haemolytic E. coli Extraintestinal E. coli Uropathogenic E. coli Neonatal Meningitis E. coli Avian Pathogenic E. coli ETEC VTEC CDTEC NTEC Enterotoxigenic E. coli Verocytotoxigenic E. coli Cell Detaching E. coli Cytolethal Distending E. coli Necrotoxigenic E. coli AEEC EIEC EAEC DAEC Attaching-Effacing E. coli Entero-invasive E. coli Enteroaggregative E. coli Diffusely-adherent E. coli 2
EPEC, VTEC and EHEC Ø Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) ü strains producing attaching/effacing lesions (AE) Ø Verocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC) ü strains producing only Shiga toxins (Stx) Ø Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) ü strains producing Stx and AE lesion ü similar to O 157: H 7 E. coli causing haemorrhagic enterocolitis 3
Shiga toxins Ø Production in the intestines Ø Crossing of the epithelium through the enterocytes Ø Reach the blood stream Ø Active in vivo on the endothelial cells of the blood vessels Ø Stop the protein synthesis in the target cells Ø Oedemas and haemorrhages Attaching/Effacing lesion Ø Attachment to the microvilli of the enterocytes Ø Injection of bacterial effectors into the enterocytes Ø Re- and dis-organization of the enterocyte cytoskeleton Ø Effacement of the microvilli of the enterocytes Ø Inflammatory reaction with cell infiltration, oedema of the mucosa and loosening of the tight junctions 4
Pathologies des EHEC - hommes • • • Infection asymptomatique Entérocolite: diarrhée Entérocolite hémorragique: diarrhée abondante et hémorragique Syndrome hémolytique urémique Syndrome purpura thrombotique thrombocytopénique - bovins • veaux (jusqu’à 3 mois): diarrhée • adultes: portage asymptomatique - autres ruminants: portage asymptomatique - autres espèces : de manière anecdotique 5
Pathologies des EHEC 6
Epidemiology of EHEC ? ? young calves ? adult ruminants ? EHEC humans ? 7
Epidemiology of EHEC Ruminants ? Direct contacts ? Humans Meat, milk Vegetables, fruits Faeces Swimming waters Intestinal content, faeces Dung, manure Drinking water Soils Waters 8
Enterohemorrhagic [EHEC] / Verotoxigenic [VTEC] Escherichia coli en production primaire Dr Hein Imberechts Laboratoire Nationale de Référence pour les E. coli zoonotiques, santé animale 9
Contenu • • Définitions Clinique Virulence des VTEC chez les ruminants Le diagnostic Programmes officiels, monitoring Mesures Portage de VTEC en Belgique et en Europe 10
Définitions • VTEC: produisent vérocytotoxines (VT), ou « Shiga toxins » (Stx) [voir Shigella dysenteriae] • EHEC – VTEC considéré très pathogène pour l’homme – Mais: pas toujours HUS, HC (maladie grave) 11
Définitions • E. coli O 157 – Non-O 157: e. a. O 26, O 91, O 103, O 111, O 145 • Typique – atypique: réfère à la production des lésions A/E et (ou) la présence du plasmide EHEC • E. coli zoonotiques - autres VTEC – Problème de diagnostic 12
Clinique • UE: 1. 2 cas par 100. 000 habitants (EFSA, 2005) • Infection – – Aliments contaminés Eaux Contact direct & indirect: ruminants infectés Contact avec personnes infectées • Clinique – HUS, HC, BD – Diarrhée, mal de ventre, sans symptômes 13
Virulence • Facteurs de virulence – Toxines Stx 1, Stx 2 – Adhésines Eae – Locus of Enterocyte Effacement – Plasmide, Ehx (marqueur de virulence) – Autres 14
Virulence LEE locus Nataro and Kaper 1998 15
Virulence • Stx: encodé par phage, donc pas stable • Variants 16
Virulence • Séropathotype: combination de sérotype, stx subtypes, présence des facteurs de virulence et association avec maladie chez l’homme – Seropathotype A strains (VTEC O 157) have a high relative incidence, commonly cause outbreaks and are associated with HUS – Seropathotype B strains (O 26: H 11, O 103: H 2/NM, O 111: NM, O 145: NM, O 121: H 19) have a moderate incidence and are uncommon in outbreaks, but were associated with HUS – Seropathotype C strains (O 91, O 104 and O 113 all of H-type 21) are associated with HUS, but these strains were of low incidence and rarely caused outbreaks – Seropathotypes D and E are not HUS-associated and are uncommon in man or found only in non-human sources 17
Virulence • « Deux lignées » de VTEC O 157; une plus associée avec maladie chez l’homme • Variants de Stx & pathologie • Conclusion: à l’heure actuelle, on ne peut pas identifier une souche pathogène pour l’homme 18
VTEC chez les ruminants • VTEC et diarrhée – Souvent stx 1 • VTEC sans signes cliniques • Implications pour le diagnostic et le monitoring 19
Le diagnostic • Isolement E. coli O 157 – m. TSB+novobiocine; IMS (Dyna. Beads); CTSMAC; agglutination • Cefixime Tellurite Sorbitol Mac. Conkey • Méthode normalisée et validée (ISO 16654) • Autres – En développement – Détection moléculaire: gènes appartenant à plusieurs souches 20
Le diagnostic • Confirmation par sérotypie – Antigène O: LPS, sucres – Antigène H: flagelles, protéines – Agglutination • Confirmation par biochimie (O 157) – b-glucoronidase (négative) – Sorbitol (fermentation lente) 21
Le diagnostic • Confirmation par PCR – Gènes: facteurs de virulence – Polymorphismes • Vérotoxines Stx 1, Stx 2 • Adhésine Eae (a, b, g, …) • Protéines du LEE • Typage (tracing) – PFGE: génome – Stx 1, Stx 2 – Phage 22
Le diagnostic • Tests sérologiques (ELISA) – Anti-O 157 – Anti-Stx – Anti-Eae 23
Programme … • … officiel en production primaire – Il n’y en a plus depuis 2005 • Avant 2005 – Détection à l’abattoir – Tracing back de la ferme d’origine (Sanitel) – Echantillonnage • 20% entre 6 mois et 2 ans, aliment, poussière • PCR – Mesures d’hygiène sur la ferme 24
Programme • Site de colonisation ? – Echantillonnage spécifique ? • En fonction de – la nourriture – la saison –… • Plusieurs souches sur une exploitation 25
Monitoring • Données comparables ? Evolution ? • Infections chez l’homme & détection de VTEC pathogènes: – la population animale – les carcasses et viande à l’abattoir – les échantillons environnementaux qui peuvent être contaminés par matière fécale et eaux – ready to eat foods qui peuvent être contaminés par matières fécales • Sérotypes: E. coli O 157, O 26, O 91, O 103, O 111 et O 145 26
Monitoring • Recommandation EFSA – Caractériser toute VTEC (animaux, aliments, environnement), par méthodes harmonisées • Sérotypage • Lysotypie (VTEC O 157) • Typage gènes vtx et eae – Typage moléculaire • PFGE – Collection centralisée et comparaison des résultats 27
Monitoring chez les animaux • L’isolement de VTEC indique la présence ubiquitaire dans l’environnement • Bovins > moutons & chèvres > animaux de compagnie, faune sauvage, … >>> porc, volaille, … • Tenir compte des différences locales – La population – Les pratiques agricoles – La consommation alimentaire, … 28
Monitoring chez les animaux • Problème: l’excrétion de VTEC O 157 – Transitoire – Différences quantitatives – Influencée par l’âge et l’alimentation • Monitoring est lourd et cher • Utile en cas de risque, p. ex. ferme ouverte au grand public 29
Mesures • GHP à l’abattoir et à l’atelier de découpe, monitoring pour indicateurs comme Enterobacteriaceae et E. coli • Procédures HACCP pour aliments susceptibles à être contaminés • Monitoring des bovins, de la ferme, de l’aliment en cas d’études spécifiques • Recommandation: d’abord E. coli O 157, puis d’autres sérotypes, avec des méthodes harmonisées 30
Portage de VTEC • EFSA: zoonoses, BIOHAZ • http: //www. efsa. europa. eu/EFSA/ • Enternet • http: //www. hpa. org. uk/hpa/inter/enternet_menu. htm • Pub. Med • http: //www. promedmail. org/ • AFSCA, Zoonotic agents in BE • http: //www. favv. be/home/pub/doc 07/Report_TS_2 005_S. pdf 31
Portage de VTEC • Belgique – Peu de données, sauf aux abattoirs • Europe – Chiffres sont confus 32
Escherichia coli entéro-hémorragique chez l’homme Christiane Duchesnes Janvier 2008 33
Escherichia coli Pathotype: EHEC Sérotypes: O 157: H 7; le plus fréquent O 26, O 103, O 111, 0145, … Facteurs de virulence adhésion aux entérocytes et effacement des microvillosités sécrétion de toxines: Stx 1 et Stx 2 Réservoir Tube digestif de l’homme et de l’animal (ruminants) Contamination Ingestion: aliments contaminés par MF, crus ou peu cuits (hamburgers, produits à base de lait cru, légumes, …) Incidence Varie selon le pays; <2 cas/100 000 hab/an 34
Physiopathologie www. cdc. gov/ncidod/eid/vol 8 no 5/01 -0385. htm. Diarrhée séro-sanglante Tube digestif EHEC Toxine Microangiopathies (surtout rénales) 35
Tableau clinique Diarrhée sérosanglante Colite hémorragique Douleurs abdominales Peu de fièvre Cas groupés souvent liés à la restauration rapide 36
Traitement Réhydratation Antibiotiques à éviter Complications Risques ++: enfants <3 ans; adultes de >65 ans 10% Syndrome Hémolyse-Urémie (SHU) (incidence: 0, 5 cas/100000 enfants<15 ans /an) Rare Purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) 37
SHU (= HUS) MICROANGIOPATHIE (lésions endothéliales) è INFLAMMATION è Fragmentation des GR dans les lésions: anémie hémolytique è Hb basse, réticulocytes et schizocytes è Pâleur, (sub)ictère è MICROTHROMBI è Thrombopénie par consommation, pétéchies, purpura è INSUFFISANCE RENALE AIGUË è Oligo-anurie, oedèmes, prise de poids, hypertension artérielle, urémie 38
SHU traitement Symptomatique: Dialyse péritonéale SHU évolution ¾ cas évoluent vers la guérison < 5% mortalité Séquelles possibles: IRC HTA 39
Evaluation du risque lié aux VTEC et E. coli O 157 entérohémorragiques dans les aliments en Belgique Georges Daube Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Microbiologie des Denrées Alimentaires Sart-Tilman, bât. B 43 bis 4000 Liège tél. 04 -366. 40. 15 fax 04 -366. 40. 44 http: //www. mdaoa. ulg. ac. be/ Georges. Daube@ulg. ac. be Avec l’aide de : Katelijne Dierick, ISP 40
Plan de l’exposé • Introduction – Evaluation des risques – Méthodes de recherche dans les aliments • Appréciation du risque dans la filière « viande » – Identification du danger – Evaluation de l’exposition – Caractérisation du danger – Caractérisation du risque • Mesures de prévention dans la filière « viande » • Problématique des critères microbiologiques • Conclusions 41
Evaluation des risques partie intégrante de l’analyse des risques • Analyse des risques Evaluation des risques Gestion des risques • Evaluation des risques Evaluation scientifique de la probabilité d’occurrence et de la gravité d’effets néfastes pour la santé résultant de l’exposition de l’homme à des dangers présents dans les aliments. 1. Identification du danger 2. Evaluation de l’exposition Communication des risques 3. Caractérisation du danger 4. Caractérisation du risque 42
Principes des méthodes de recherche Pas de méthodes simples, standardisées et validées pour la recherche de VTEC non-O 157 dans les aliments d’où pas de statistiques exploitables Aucune méthode disponible pour les dénombrements Pistes envisagées (recherches en cours) - séparation immuno-magnétique basée sur le sérotype - Besoin de milieux d’isolements spécifiques - Besoin de confirmer la virulence 43
Principes des méthodes de recherche Propriétés biochimiques des E. coli O 157: H 7 semblables aux autres E. coli excepté: - Résiste au tellurite et au céfixime - Ne fermente pas le sorbitol en 24 h - Ne produit pas de β-glucuronidase La sélection et la différentiation biochimique sont basées sur ces caractéristiques 44
Méthode-type de recherche de VTEC O 157 dans les aliments • • Préenrichissement Enrichissement (Détection immunologique) Immuno-concentration (VIDAS ICE ou IMSDynal) Isolement Identification biochimique Agglutination Confirmation des facteurs de virulence par PCR 45
Schéma - Méthode Vidas ECO (1) 46
Schéma - Méthode Vidas ECO (2) 47
Concentration d’E. coli O 157 par capture par des billes immunomagnétiques 48
Schéma - Méthode Vidas ECO (3) Confirmation 49
Centre de référence: UZ-Brussels Dr. Denis Pierard • Détection des gènes codants pour les facteurs de virulence - Vérocytotoxines (shigatoxines stx 1 et 2) - Entérohémolysine - eae. A (intimine) 50
EVALUATION QUANTITATIVE DU RISQUE DANS LA FILIERE VIANDE 51
52
1. Identification du danger 1. 1. EHEC O 157 terminologie • Escherichia coli : espèce type du genre Escherichia appartenant à la famille des entérobactériacées. • VTEC-STEC : E. coli vérocytotoxinogène ou producteurs de toxine « Shiga » – souches produisant des toxines actives sur les cellules Véro (toxines VT ou stx). • EHEC : E. coli entérohémorragique. – E. coli vérocytotoxinogène qui possède les mêmes propriétés cliniques (SHU, entérocolite hémorragique), épidémiologiques et pathogéniques (propriétés attachantes/effaçantes, plasmide 60 MDa) que le clone épidémique O 157: H 7. • EHEC O 157 : E. coli entérohémorragique de sérotype O 157. A l’origine de la définition du groupe EHEC et manifestant la plus forte vitulence et le plus 53 fort potentiel épidémique.
1. 2. Physiologie (1) • Température: – Tmin : 6 -7°C; Topt : 40°C; Tmax : 45, 5°C – D 55°C : 20; D 60°C : 3; D 65°C : 0, 36; (recommandation 70°C 2’) – Pas ou peu d’effet de la congélation • p. H: – p. Hmin : 4, 2 (HCl) - 5, 5 (Ac. acétique); p. Hopt : 6, 9; p. Hmax : 9, 4 – Résistance/tolérance à l’acidité (adaptation) • Activité de l’eau (Na. Cl): – a. Wmin : 0, 953; a. Wopt : 0, 995 • Conditionnement: – Peu ou pas d’effet du sous-vide ou de l’atmosphère modifiée 54
1. 2. Physiologie (2) • Additifs: – – Nitrites: efficace à p. H < 5, 5 Acides organiques Bactériocines Phosphates • Rayonnements: – ionisation – RX – UV • Hautes pressions • Ozone 55
1. 4. Symptomatologie 56
Résultat des surveillance VTEC en Belgique chez l’homme (2000 -02) Serotype Freq O 157 4, 018 % Serotype % O 146 65. 3 O 26 358 5. 8 O 103 347 5. 6 O 91 208 Freq 1. 0 O 128 109 1. 8 O 111 76 1. 2 56 0. 9 3. 4 O 145 60 O 113 39 0. 6 O 8 27 0. 4 Other 57 859
1. 5. Mode de transmission • Indirect – Consommation d’aliments contaminés : - denrées alimentaires d’origine animale (bovine) : « hamburgers » insuffisamment cuits (USA), salami, lait cru, produits laitiers non pasteurisés … - denrées alimentaires d’origine végétale – Consommation d’eau de boisson contaminée. – Baignade, pâture contaminée. • Direct – Transmission directe de l’homme à l’homme ou de l’animal à l’homme. 58
Modes de transmission AFSSA 59 2003
Aliments associés AFSSA 602003
Prévalence EHEC O 157 en Belgique (source ULg, RUG, AZ-VUB et IEV) Coprocultures humaines: 1% EHEC et 0, 2 % EHEC O 157; lysotypes variés. Coprocultures bovines à l’abattoir : 6% EHEC O 157 (1998 -99). Carcasses de boeuf: en 1997 (400 cm 2): 9/6010 (0, 15 %); en 1999 (1. 600 cm 2 ): 16/1620 (1 %); en 2002 (1. 600 cm 2): 13/1215 (1, 1%) en 2000 (1. 600 cm 2): 7/1501 (0, 5%); en 2003 (1. 600 cm 2): 10/1479 (0, 7%) en 2001 (1. 600 cm 2): 13/1388 (0, 9%); en 2004 (1. 600 cm 2): 18/1319 (1, 4%) Découpe de boeuf (25 g) : en 2002: 0/222 (0%); en 2003: 2/285 (0, 7%); en 2004: 2/244 (0, 8%) Viande hachée de boeuf (25 g) : en 1999: 1 / 984 (0, 1%); en 2000: 1/487 (0, 2%); en 2001: 0/298 (0%); en 2002 : 0/297 (0%); en 2003 : 5/298 (1, 7%); en 2004 : 1/332 (0, 3%) Autres viandes (veau, porc, volailles, lapins) : 0 EHEC O 157 /1. 500 Lait cru : 0/123 (2006); Fromage au lait cru de vache : 5/271 (1, 8%)61 (2006)
Evaluations internationales 62
Evaluation du risque « viande hachée de bœuf » USDA 2001 63
2. Evaluation de l’exposition Principales étapes à envisager Contamination Dilution Destruction Contamination croisée Multiplication 64
2. 1. Elevage • La prévalence d’exploitations positives est très variable • La prévalence intra-exploitations est aussi très variable • Le type de bétail (veaux, taurillons, vaches) • La dynamique temporelle dans les exploitations (effet alimentation, saison, etc. ) • L’excrétion à l’abattoir et sa dynamique temporelle sont similaires à celles observées dans les élevages 65
2. 1. Elevage: données belges • Informations manquantes - Collecter des informations concernant le type d’élevage et d’alimentation, l’âge des animaux, les saisons, les probiotiques, les immunisations et à partir de celles-ci en évaluer le risque différentiel. - Réaliser des études concernant le nombre de EHEC O 157 / gr de matières fécales. 66
2. 2. Abattoir: données belges • Prévalence de carcasses contaminées sur 1. 600 cm 2 par EHEC O 157 : 1, 01 % (n = 8. 522) • Prévalence de carcasses contaminées sur 400 cm 2 par EHEC O 157 : 0. 15 % (n = 6. 010) • Nombre de EHEC O 157 : - 1 ufc/cm 2 et 200 ufc/cm 2. - 82% des + avec < 1 ufc/400 cm 2. • Nombre d’E. coli /cm 2 : 95% < 100 ufc / cm 2. 90% < 10 ufc / cm 2. 70% < 1 ufc / cm 2. 45% < 1 ufc / 10 cm 2. 67
2. 2. Abattoir: données belges • Informations manquantes - Préciser les niveaux de contamination - Investiguer les facteurs de contamination croisée en fonction du type d’abattoir. - Tenir compte de l’influence des fortes contaminations fécales accidentelles à l’abattoir. 68
2. 3. Découpe et hachage: données belges • La prévalence des morceaux de découpe contaminés par EHEC O 157 est faible : 0, 5% (n = 751). • La prévalence de EHEC O 157 dans la viande hachée de bœuf est de 0, 3% (n = 2696). • 75 % des viandes hachées de boeuf contiennent < 100 cfu/g 69
2. 3. Découpe et Hachage: données belges • Informations manquantes - Préciser l’importance relative des filières belges de production. - Déterminer en termes d’augmentation, de stabilisation ou de diminution de EHEC O 157 l’influence des pratiques suivantes : – L’utilisation ou non de la congélation avant le hachage. 70
2. 3. Découpe et Hachage: données belges – Le travail à partir de petits ou gros morceaux de découpe. – Le nombre d’animaux différents intervenant au sein d’un même lot de hachage. – L’utilisation ou non de chutes de découpe en boucherie. – La possibilité de contamination d’origine humaine différente d’une filière à l’autre. 71
2. 4. Stockage, Conditionnement et Distribution: données belges • Température moyenne / filet américain / supermarchés : 5 °C. • Température / comptoirs réfrigérés : 70% supermarchés : t° 7°C. • DLC : 48 heures. • Conditionnement : barquette en frigolite ou en plastique avec film perméable à l’air. • Taille du conditionnement : 150 - 200 grs, 500 grs. • p. H du filet américain préparé : 5 - 5. 35. 72
2. 5. Consommation: données belges • Le % de conditionnements de viande hachée contaminés : 0 EHEC O 157 sur 194 échantillons. • La quantité de filet américain consommé / an : 2 kg 320. • La consommation de hamburgers insuffisamment cuits est ignorée • Le nombre estimé de consommateurs de filet américain: 5. 329. 485. • La quantité estimée de filet américain consommé / repas : 150 g. • Le nombre moyen de repas de filet américain par an : 15. 73
3. Caractérisation du danger Relation dose-réponse • Dose infectieuse faible +/-50 cellules ingérées 4. Caractérisation du risque: données belges Carcasses de bœuf 1, 01 % EHEC O 157 + - 0, 82 % < 1 ufc/400 cm 2 - 0, 18 % > 1 ufc/400 cm 2 Viande hachée de bœuf 0. 30 % EHEC O 157 + Nombre de repas / an 15 Taille de la portion consommée par repas 150 g Population globale 10. 192. 264 42 cas de SHU (=1996) 4 cas mortels 74
4. Caractérisation du risque: données belges
PREVENTION DU RISQUE DANS LA FILIERE VIANDE 76
Points essentiels à maîtriser • Elevage : portage, niveau de portage. • Abattage : prévalence de carcasses contaminées, niveau de contamination. • Découpe, hachage : prévalence et niveau de contamination en jouant sur congélation, quantité et origine de la viande de découpe. • Stockage, conditionnement et distribution : respect strict de la chaîne du froid. • Consommation : adopter le mode de consommation, respect de la chaîne du froid. • Communication : stratégies de prévention : conseils pour acteurs de la filière et populations à risque. 77
Points essentiels à maîtriser • Traitement des carcasses avec fortes contaminations fécales: – Parage des contaminations visibles – Déclassement des « accidents d’éviscération » – Perte d’agrément pour « mauvais » abattoirs • Tests systématique de carcasses pour « filet américain » Réduction du niveau de contamination par EHEC O 157 en début de filière 78
Points essentiels à maîtriser • Elevage : portage, niveau de portage. • Abattage : prévalence de carcasses contaminées, niveau de contamination. • Découpe, hachage : prévalence et niveau de contamination en jouant sur congélation, quantité et origine de la viande de découpe. • Stockage, conditionnement et distribution : respect strict de la chaîne du froid. • Consommation : adopter le mode de consommation, respect de la chaîne du froid. • Communication : stratégies de prévention : conseils pour acteurs de la filière et populations à risque. 79
Points essentiels à maîtriser • Absence de consommation de viande crue de bœuf par les populations à risque: – Enfants moins de 15 ans – Personnes âgées 80
Critères microbiologiques Pas de critères dans le règlement (CE) N° 2073/2005 Limites d’actions de l’AFSCA pour contrôles officiels: 81
Critères microbiologiques Avant de fixer des critères européens (DG SANCO) Avis 2007 de l’European Food Safety Authority (EFSA): - Priorité = VTEC O 157 - Surveillance abattoir - Surveillance chute de découpe - Méthodes à développer pour VTEC non-O 157 82
Conclusion • Bonne connaissance de la prévalence, du niveau de contamination d’ E. coli O 157 à tous les niveaux de production du filet américain. • Comment établir un lien entre ces différentes étapes ? - Modélisation mathématique probabiliste. - Manque d’experts indispensable pour définir les données adéquates à introduire dans le modèle. - Besoin de données quantitatives. • Prévention de EHEC au sein d’un aliment cru est difficile. - Mise en place de programmes d’assurance de sécurité alimentaire à chaque étape de production dont surtout l’abattoir: BPH - HACCP - Information du consommateur. • Besoin de critères uniformes européens 83
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