SEROLOKE REAKCIJE INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE Prof

SEROLOŠKE REAKCIJE INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE Prof. dr IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ

DEFINICIJA SEROLOŠKIH REAKCIJA • SEROLOŠKE REAKCIJE SU REAKCIJE ANTIGEN (Ag) ANTITELO (At) U USLOVIMA IN VITRO. • ANTIGEN + ANTITELO KOMPLEKS koji može da se vidi ili dokaže na drugi način

DEFINICIJA SEROLOŠKIH REAKCIJA • NA OSNOVU STVORENOG KOMPLEKSA PRIMENOM POZNATOG ANTIGENA MOŽE SE DOKAZATI NEPOZNATO ANTITELO ILI OBRNUTO (primenom poznatog antitela dokazati nepoznati antigen)

PRIMENA SEROLOŠKIH REAKCIJA • U DIJAGNOSTICI U VIRUSOLOGIJI, BAKTERIOLOGIJI, PARAZITOLOGIJI ZA POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE ODNOSNO UTVRĐIVANJE UZROČNIKA BOLESTI • U TIPIZACIJI KRVNIH GRUPA ERITROCITA I HISTOKOMPATIBILNIH ANTIGENA LEUKOCITA • ZA DOKAZIVANJE PROTEINA SERUMA, ONKOFETALNIH ANTIGENA, AUTOANTITELA, KOMPONENTI KOMPLEMENTA

VRSTE SEROLOŠKIH REAKCIJA • SEROLOŠKE REAKCIJE ETIOLOŠKOG SPECIFITETA Ag su napravljeni od uzročnika bolesti koju dokazujemo • SEROLOŠKE REAKCIJE SLUČAJNOG SPECIFITETA Ag nisu napravljeni od uzročnika bolesti nego su samo slučajno sa uzročnikom antigenski srodni pa mogu da reaguju sa antitelima nastalim u infekciji tim uzročnikom

SEROLOŠKE REAKCIJE ETIOLOŠKLOG SPECIFITETA • • • IMUNOENZIMSKI TEST ELISA IMUNOFLUORESCENTNI TEST IFT RADIOIMUNOESEJ RIA NEUTRALIZACIONI TEST NT REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA REAKCIJA INHIBICIJA HEMAGLUTINACIJE • AGLUTINACIJA i PRECIPITACIJA

SEROLOŠKI TESTOVI KOJI KORISTE OBELEŽENA ANTITELA • TESTOVI IMUNOFLOURESCENTNE MIKROSKOPIJE (IFT) • IMUNOENZIMSKI TESTOVI (ELISA) • RADIOIMUNOTESTOVI (RIA) • OVIM TESTOVIMA DOKAZUJU SE KLASE IMUNOGLOBULINA Ig. M, Ig. G, Ig A, Ig. E zavisno od specifiteta antitela koje je obeleženo enzimom, fluorohromom ili radioaktivnim izotopom

TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT • 1. DIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA • PRIMENJUJE SE ZA DOKAZIVANJE ANTIGENA MIKROORGANIZAMA • IZVODI SE NA PREDMETNOM STAKLU • POTREBAN JE FLUORESCENTNI MIKROSKOP KOJI IMA ŽIVINU SIJALICU I SPECIJALNE FILTRE TE EMITUJE UV ZRAKE

TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT • 1. DIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA princip testa • bolesnički uzorak ( u kome dokazujemo Ag ) fiksiran JE na predmetnom staklu + At specifično za Ag obeleženo fluorohromom PRI ISPIRANJU SE NE SPIRA ako je formiran kompleks Ag-At • Ovako pripremljeni uzorak se MIKROSKOPIRA NA IMUNOFLUORESCENTNOM MIKROSKOPU

TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT • UKOLIKO JE U BOLESNIČKOM UZORKU PRISUTAN ANTIGEN SPECIFITETA PRIMENJENIH At obeleženih fluorohromom u preparatu se javlja FLUORESCENCIJA POZITIVAN IFT TEST HERPES SIMPLEX VIRUS U ĆELIJAMA VEZIKULA

TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT • 2. INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA TEHNIKA (IIFT) • 2. a IIFT ZA DOKAZIVANJE At • 2. b IIFT ZA DOKAZIVANJE Ag

FTA – Indirektna imunofluorescentna tehnika • • Dokazuju se i Ag i At Indirektna FTA za Ag + At inkubacija, ispiranje Dodavanje anti. At markiranog fluorohromom Ag-At-anti. Atmark. Inkubacija, ispiranje • Fluorescentni mikroskop UV zraci • Kompleks Ag-At-Atmark. FLUORESCIRA

Pozitivan INDIREKTNI IMUNOFLUORESCENTNI TEST ZA ANTIGEN RSV

IMUNOFLUORESCENTNA TEHNIKA ZA DOKAZIVANJE CMV ANTIGENEMIJE • • • PREDNOSTI kvalitet uzorka se vidi, mora sadržati intaktne virusom inficirane ćelije jednostavna priprema preparata i dobijanje rezultata za 1 -2 h NEDOSTACI subjektivna metoda obučenost za mikroskopiranje

FTA – Indirektna imunofluorescentna tehnika za Ag NEGATIVAN TEST • Ø + At( inkubacija, ispiranje) • Dodavanje anti. At markiranog FITC (inkubacija, ispiranje) • UV zraci fluorescentnog mikroskopa • NEMA FLUORESCENCIJE jer se At obeležena hluorofromom spiraju

PRINCIP INDIREKTNOG IMUNOFLUORESCENTNOG TESTA PRIMENOM POZNATOG Ag DOKAZUJEMO At TOG SPECIFITETA U SERUMU

FTA – Antrikomplementarna imunofluorescentna metoda • Za dokazivanje Ag • +Ag + At + C(inkubacija, ispiranje) • Ag-At-C + anti. C 3 markiran fluorohromom (inkubacija, ispiranje) • Fluorescentni mikroskop UV : kompleks Ag-At-C- anti. C 3 markiran FLUORESCIRA

ELISA TESTOVI • Za dokazivanje Ag 1. DIREKTNA SENDVIČ ELISA 2. INHIBICIONA 3. KOMPETITIVNA • Za dokazivanje At 1. DIREKTNA KOMPETITIVNA 2. INDIREKTNA ELISA

SEROLOŠKA DIJAGNOZA ELISA TEST ELISA test

DIREKTNA SENDVIČ ELISA • Za dokazivanje Ag Bazenčić obložen At specifičnim za Ag koji se dokazuje • Dodavanje ispitujućeg uzorka • Dodavanje At specifičnih za traženi Ag markiranih enzimom (E) (inkubacija, ispiranje) • Dodavanje substrata • KVANTITATIVNA ELISA (intenzitet boje ukazuje na količinu ag u uzorku)

INHIBICIONA ELISA • Za dokazivanje Ag • Ag (isti kao onaj koji se dokazuje) je vezan za ploču • Dodaje se ispitujući bolesnički uzorak • Dodaju sa At obeležena E specifična za Ag koji se dokazuje (inkubacija, ispiranje) • Dodavanje substrata • IZOSTANAK POJAVE BOJE +ELISA (obeležena antitela imaju veći afinitet vezivanja za antigen iz uzorka)

KOMPETITIVNA ELISA • Za Ag • Bazenčić je obložen At specifiteta Ag koji se dokazuje • Dodaje se ispitujući uzorak • Dodaje se Ag markiran E (kao ag koji se dokazuje) (inkubacija, ispiranje) • Dodaje se substrat • IZOSTANAK POJAVE BOJE +ELISA jer Ag iz uzorka ima veći afinitet vezivanja od obeleženog Ag koji će se sprati

ELISA ZA DOKAZIVANJE ANTITELA DIREKTNA KOMPETITIVNA • BAZENČIĆ PLOČE ZA MIKROTITRACIJU JE OBLOŽEN ANTIGENOM • DODAJE SE BOLESNIČKI SERUM I ANTITELA SPECIFITETA ANTIGENA OBELEŽENA ENZIMOM • INKUBACIJA , PA ISPIRANJE I DODAVANJE SUBSTRATA At iz ispitujućeg seruma imaju većI afinitet vezivanja za Ag od enzimom obeleženih At PRISUSTVO BOJE NEGATIVNA ELISA NEMA POJAVE BOJE POZITIVNA DIREKTNA KOMPETITIVNA ELISA

PRINCIP INDIREKTNOG ELISA TESTA

INDIREKTNA ELISA • POJAVA BOJE u indirektnom ELISA testu = + ELISA • INTENZITET BOJE GOVORI O KOLIČINI ANTITELA U SERUMU. TEST MOŽE BITI KVANTITATIVAN • ENZIMI koji se primenjuju u ELISA TESTU ALKALNA FOSFATAZA PEROKSIDAZA SUPSTRAT koji se primenjuje u ELISA TESTU ORTOFENILENDIAMIN

APARATI ZA ELISA TESTOVE • ANALYSER IP 2 • MIKROPLATE READER

INTERPRETACIJA SEROLOŠKIH REZULTATA Ig. M i Ig. G negativni nema infekcije, inkubacija ili prodromalni stadijum Ig. M pozitivna Ig. G negativna početak infekcije Ig. M i Ig. G pozitivna akutna infekcija Ig. M negativna Ig. G visoko pozitivna kasna rekonvalescencija Ig. M negativna uz nisko ranije preležana bolest pozitivne Ig. G

KLASIČNI SEROLOŠKI TESTOVI • NE DOKAZUJU SE ANTITELA PO KLASAMA VEĆ UKUPNI IMUNOGLOBULINI • REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA RVK • NEUTRALIZACIONI TEST NT • REAKCIJA INHIBICIJA HEMAGLUTINACIJE RIH • AGLUTINACIJA • PRECIPITACIJA mogu se dokazati i klase imunoglobulina

REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (RVK) • INAKTIVACIJA KOMPLEMENTA U SERUMU KOJI SE TESTIRA (inkubacijom na 56°C 30 minuta) • I FAZA At (dvostruka stepenasta razređenja seruma od ¼ do 1/256) + Ag + C (inkubacija 90 min /37°C ili 18 h/4°C)

RVK • FAZA II • DODAJE SE HEMOLITIČKI SISTEM koji ima ulogu indikatora ( reakciju Ag A t čini vidljivom) INKUBACIJA 30 MIN /37°C • HEMOLITIČKI SISTEM se sastoji od HEMOLIZINA(INAKTIVISANI SERUM KUNIĆA SA ANTITELIMA PROTIV OVČIJIH ERITROCITA) I OVČIJIH ERITROCITA

RVK POZITIVNA • ISPITUJUĆI SERUM SADRAŽI At SPECIFIČNA ZA PRIMENJENI Ag FAZA I Ag+At+C= Ag-At –C (formira se kompleks Ag At i aktivira se komplement FAZA II Ag-At-C +Hem+OE =OE OSTAJU INTAKTNI • RVK POZITIVNA HEMOLIZA NEGATIVNA • OE ovčiji eritrociti/Hem hemolizin

RVK NEGATIVNA • ISPITUJUĆI SERUM NE SADRŽI ANTITELA SPECIFIČNA ZA PRIMENJENI ANTIGEN • Ag + C= Ag+C ( komplement se ne aktivira u fazi I jer se ne stvara kompleks Ag- At) • FAZA II Ag+C+Hem+OE = Ag+Hem-OE-C (hemolitički sistem aktivira C) • LIZA ERITROCITA RVK NEGATIVAN

TITAR • REZULTAT RVK SE IZRAŽAVA U TITROVIMA • TITAR JE NAJVEĆE RAZREĐENJE ISPITUJUĆEG SERUMA KOJE JOŠ UVEK DAJE POZITIVNU SEROLOŠKU REAKCIJU

OČITAVANJE RVK TESTA • RVK TEST MOŽE DA SE IZVODI U EPRUVETAMA ILI NA PLOČAMA ZA MIKROTITRACIJU

NEUTRALIZACIONI TEST (NT) • 1. ZA IDENTIFIKACIJU IZOLOVANOG VIRUSA - VIRUS NEUTRALIZACIONI TEST • 2. ZA ODREĐIVANJE TITRA NEUTRALIŠUĆIH ANTITELA U SERUM NEUTRALIZACIONI TEST

VIRUS NEUTRALIZACIONI TEST princip testa • UKLANJANJE NESPECIFIČNIH INHIBITORA : 30 min/56°C • VIRUSNI IZOLAT (živi virus) dvostruko stepenasto razređen + Inkubacija 30 min/37°C • ANTITELA specifična za virus • Inokuliše se u KULTURU ĆELIJA • IZOSTANAK CPE POZITIVAN NT • KONTROLA: VIRUS U kulturi bez At CPE+

CITOPATOGENI EFEKAT (CPE) • CPE sve citopatološke promene na ćelijama u kojima se razmnožava virus • CPE ADENO virusa uvećane, zaokružene ćelije, grupisane u tipične nakupine. Cpe adeno virus

CITOPATOGENI EFEKAT • RSV sincicijumi i blede eozinofilne inkluzije u citoplazmi • Javlja se između 3 -7 dana

Citopatogeni efekat HSV virusa CPE UVEĆANE ĆELIJE SA CITOPLAZ MATSKIM GRANULA CIJAMA Javlja se za 5 -14 dana • IZOLACIJA U KULTURI ĆELIJA CPE HSV na kulturi ćelija

SERUM NEUTRALIZACIONI TEST princip testa • UKLANJANJE NESPECIFIČNIH INHIBITORA U ISPITUJUĆEM SERUMU • Ag(živi virus) + ISPITUJUĆI SERUM • KULTURA ĆELIJA (inkubacija na 35°C) • CPE – NT + CPE + NT – • REZULTATI SE IZRAŽAVAJU U TITROVIMA (1/10, 1/20 I sl. )

REAKCIJA INHIBICIJE HEMAGLUTINACIJE princip testa • 1. INAKTIVACIJA NESPECIFIČNIH INHIBITORA HEMAGLUTINACIJE U SERUMU • 56°C/30 MIN • PERJODATOM, RDE, TRIPSINOM • 2. RAZREĐIVANJE SERUMA • 3. DODAVANJE ANTIGENA HEMAGLUTININA /INKUBACIJA SOBNA TEMP/45 MIN

RIH OČITAVANJE • 4. DODAVANJE ERITROCITA (Er) koji su indikatori reakcije antitela i virusa • 5. OČITAVANJE RIH

Interpretacija rezultata klasičnih seroloških testova test RVK RIH NT RVK 1. uzor. 2. uzor. interpret acija manje 1/8 akutna od 1/4 infekcija 1/40 1/160 akutna infekcija 1/10 1/20 ranija infekcija 1/32 1/64 ranija infekcija