Separationsmetoder Separationsmetoder Kromatografi gas GC eller vtska LC

Separationsmetoder

Separationsmetoder • Kromatografi, gas (GC) eller vätska (LC) • Elektrofores • Masspektrometri

Kromatografi • Gaskromatografi, GC Separation av t. ex. alkoholer, fetter, … • Vätskekromatografi, LC (t. ex HPLC) Separation av vattenlösliga ämnen som ej tål höga temperaturer t. ex. proteiner, DNA, …

Kromatografi • Provet passerar en kolonn som separerar partiklarna med avseende på storlek eller kemiska egenskaper beroende på kolonnmaterialets egenskaper

• Separationen sker genom att en rörlig fas med de lösta ämnena rör sig genom en fast fas (stationär fas). • Den rörliga fasen kan vara i vätske- eller gasform. • Den stationära fasen kan vara i fast eller vätskeform (gel)

Gaskromatograf

FID detektor

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Affinitetskromatografi

Kromatogram från HPLC

Diod-Array detektor

Elektrofores

Elektrofores • Separation av t. ex. proteiner eller DNA fragment efter storlek och ladding. • Bestämning av DNA sekvens, sekvensering

Elektrofores • Joner separeras i en gel genom att de utsätts för ett elektriskt fält. • Jonerna kan separeras på grund av sin laddning och storlek.

Sekvensering

Kapillär-elektrofores

Mass spektrometri MS Separation av joner med avseende på massa och laddning

Mass -spektrometer

Mass-spektrometri Historiskt perspektiv • J. J Thompson : Upptäckte att Neon hade flera isotoper c: a 1900. Fragmentering av molekyler. • Dempster : konstruerade första ms med riktningsfokusering c. a 1920, elektron källa. Användes t. ex vid anrikning av U-235 första Atombomben.

Mass- spektrometri (MS) • • • Bestämma massan på molekyler och atomer Framställa fragment i gasform av provet Mäta massan på fragmenten. Fragmenten ger ett fingeravtryck av provet Studera relativa andelen av olika fragmentens massor. • Studera relativa andelen av olika isotoper.

Principen för en enkel Mass Spektrometer (MS) massan = m laddningen = q r r är unik för ett värde på kvoten m/q

Princip för MS Acceleration i elektriskt fält E + 4000 V 0 V + F + + v E d F = q*E mv 2/2 = q* U v 2 = q* V*2/m Böjning i magnetfält F= q*v * B m/q = B * r/v F = mv 2/r XXXXX r F XXXXX B v XXXXX F

Joniseringsmetod Electron Impact Ionization

Exempel på vanliga fragment

Mass spektrum av benzyl alkohol

Joniseringsmetoder Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Mass-spektrum

Joniseringmetoder Electronspray (ESI) • • 1 – 5 k. V spänning då areosolen lämnar kapillären. ”dropparna” torkar in (”hyperladdning”) Coulombic explosion Jonerna i gasfas

Joniseringsmetod Electron spray

”rå-spektrum” från ESI-MS

Analysmetoder (MALDI) To. F

Analysmetoder Quadropole mass filter -(U+Vcos(wt)) +(U +Vcos(wt))

GCMS homepage. univie. ac. at/Wolfgang. Werther/Folie 1. JPG

Historiskt perspektiv • GC-MS mitten på 50 -talet. Test av läkemedel, hormoner, föroreningar, … • MALDI (1985), ES-MS (1988) m. fl. har gett möjlighet att studera stora biomolekyler. (Nobelpris 2002) Kan användas vid diagnos av t. ex Malaria och Cancer (äggstock-, prostata-, bröst-)

Jonisationsmetoder Jonisations metod Typisk molekyl Prov preparation Mass range Egenskaper EI Liten flyktig GC/vätske eller fast prob -1000 Da Hård ger struktur info CI Liten flyktig GC/vätske eller fast prob - 1000 Da Mjuk ESI Peptid/protein LC/spruta - 200 000 Da Mjuk / multiladdad FAB Kolhydrater Prov +Matrix - 6000 Da Hårdare än ESI MALDI Peptid/protein Prov +Matrix - 500 000 Da mjuk