Separacin de clulas y fraccionamiento subcelular Mtodos fsicos

Separación de células y fraccionamiento subcelular

Métodos físicos de SEPARACION DE CELULAS * Necesarios para estudiar: - Tejidos con diferentes tipos celulares - Células con diferente funcionalidad/ actividad biológica - Subpoblaciones celulares con diferentes marcadores moleculares - Alternativa a la clonación: + rápidos, + rendimiento, (- pureza) * Los más empleados explotan diferencias en: – Tamaño celular – Densidad – Carga/Química superficial – Dispersión de la luz (light scatter) – Emisión de Fluorescencia

b

Beckman J 2 -21 M, centrífuga equipada con un rotor y sistema de elutriación

Rotor de elutriación (Beckman)

Cámara de separación del rotor de elutriación

Separacion de células por elutriación Apariencia de las células aisladas de una fraccion de elutriación de células sanguíneas de la médula ósea humana cultivadas durante 8 días (a, b). Las células predominantes son de tipo fibroblastoide con un núcleo central, citoplasma difuso y pseudopodos aderentes y células grandes, redondas con un estrecho citoplasma y un núcleo central redondo. (tinción con hematoxilina). (a) x 200; (b) x 400. (c) Apariencia de las células aisladas de la misma fracción de elutriación y cultivadas en DMEM+20% FCS suplementado con dexametasona, ácido ascorbico y b-glicerofosfato durante 8 días. En esas condiciones, las celulas presentan una morfologia redondeada o cuboidal con un núcleo central, x 200.

Separación de células sanguíneas con Ficoll-Hypaque Centrifugación

Separación inmunomagnética

Selección positiva Selección negativa

Absorción de luz por un e- y la subsiguiente emisión de E como calor y fluorescencia

Esquema de un Citómetro de Flujo (FACS)

Funcionamiento de la boquilla vibradora de un citómetro de flujo

Representación de los datos en citometría de flujo Green fluorescence

Esquema de un Citómetro de Flujo clasificador (“sorter”) Puede seleccionar 1/1000 células y clasificar miles/s

Microdisección con láser Sperm Tail Removal Biopsy at the Single Cell Level

Fraccionamiento de componentes subcelulares • Diseñados inicialmente para comprender el papel bioquímico de cada orgánulo en la célula • La lisis (rotura) celular se suele realizar por: Potter, homogeneizador mecánico de tejidos, sonicación, cavitación, soluciones hipotónicas • La separación de los componentes subcelulares se realiza generalmente por centrifugación

Homogeneización de la muestra Centrífuga de alta velocidad Potter

Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial 80. 000 x g, 1 h (ultracentrífuga) 1000 x g, 10 min 150. 000 x g, 3 h 20. 000 x g, 20 min citosol

5 -20% Comparación de la sedimentación por velocidad (A) y por equilibrio de sedimentación (isopícnica, B)

Purificación de orgánulos por centrifugación en gradiente de densidad

Control de calidad del fraccionamiento: TEM Núcleos Microsomas (RER) Peroxisomas