SEJT S SZVETTENYSZTS OK 2013 SEJTTENYSZTS 2 A
- Slides: 72
SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013)
SEJTTENYÉSZTÉS 2 A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása ELŐNYEI: KORLÁTAI: • Jól definiált és módosítható • Nem modellezi a környezet • Meghatározott sejttípusok szervezet komplexitását • Spontán in vitro evolúció • Nagy mennyiségű sejt nyerhető • Sok sejtfunkció vizsgálható • Állatkísérletek részbeni kiváltása • Vizsgálhatók emberi sejtek 2
SEJTTENYÉSZET Növekedési mód: Típus: Monolayer • Szuszpenzió • Primer tenyészet • Sejttörzs • Sejtvonal •
Egyetlen sejt - SEM Sejtkolónia 0. 01 mm Petricsésze sejtkolóniákkal 100 mm 3
PRIMER TENYÉSZET • A sejtek közvetlenül egy szövetdarabból származnak Először 1907 -ben alkalmazták: 1 nap Gerincvelő explantátum + nyirok A tenyészetben axonok jelennek meg! 4
Tenyésztett neuron fejlődő nyúlványokkal 5
SEJTTÖRZS • Primer tenyészetből ered Sejtek izolálása Szövetdarab =explantátum tápfolyadék Sejtek kiültetése sejtek tenyésztőedény • A letapadt sejtek osztódnak, növekednek és monolayert képeznek • Tápfolyadék szükséges a növekedéshez • 50 -100 osztódás után a sejtek meghalnak (Hayflick szabály) 6
SEJTVONAL • Halhatatlan, immortalizált • Genetikai hibák (aneuploidia) • Kontaktgátlás elvesztése • Korlátlan növekedés • Csökkent adhéziójú, esetleg szuszpenziós tenyészet • Egérben tumort képezhet • Vagy transzformálódott sejtekből ered (spontán vagy karcinogének, vírusok, besugárzás révén) pl. 3 T 3 21 F vonal, CHO • Vagy tumorból származik pl. He. LA vonal - méhnyakrákból származó (Henrietta Lacks, 1951) 7
Normális Kontaktgátlás van Vírus transzformált Egymásra növő, felgömbölyödő sejtek 8
normális sejtek SEM transzformált sejtek 9
10
He. La monolayer sejttenyészet Egymásra nőtt sejtek A sejtmorfológia változik a denzitással!! 11
OLDOTT ANYAGOK • Tápfolyadék • Szérum • Hormonok • Növekedési faktorok • Letapadási faktorok STERILITÁS + OPTIMÁLIS KÖRNYEZETI FELTÉTELEK, MÁTRIX KÖLCSÖNHATÁSOK • Tenyésztő felület pl. műanyag, üveg, membránok, mikrogyöngyök • Bevonat (coat) pl. kollagén, zselatin, feeder layer (tápláló sejtréteg) Matrigel, Biomatrix SEJTEK ÉS SEJTKÖLCSÖNHATÁSOK • Sejtkölcsönhatás: homológ = sejt denzitás heterológ = együtttenyésztés (co-culture) • Metabolitok és termékek autokrin és parakrin hatás • Anyagcsere ráta FIZIKAI PARAMÉTEREK • Hőmérséklet • p. H (indikátor+puffer) • Oxigén/Széndioxid konc. • Páratartalom • Ozmolaritás • Statikus vagy dinamikus tenyészet 12
SEJTSZÁMOLÁS • Mit? Összsejtszámot Ø Csak az élő sejteket – pl. tripánkék exklúzió után Ø • Mivel? Hemocitométerrel (Általában Bürker-kamrával) Ø Automatizált sejtszámlálóval (pl. hematológiai citométer vagy FACS stb. ) Ø 14
Automatizált sejtszámlálás A mérés alapja: vagy impedancia meghatározás vagy fényszóródáson alapuló meghatározás
Különböző típusú hemocitométerek Neubauer Tökéletesített Neubauer Thoma Burker Módosított Fuchs-Rosenthal 16
TRIPÁNKÉK EXKLUZIÓ (KIZÁRÁS) = CSAK A HALOTT SEJTEK FESTŐDNEK Élő sejt Halott sejtek H H 17
1 mm Az 1 mm 2 -en számolandó sejtek 18
A 3 vonallal határolt négyzet össztérfogata = 1 mm 2 x 0, 1 mm = 0, 1 mm 3 = 10 -4 ml (= 0, 1 cm x 0, 01 cm =10 -4 cm 3 = 10 -4 ml) 19
A SEJTSZÁM VÁLTOZÁSA AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN Konfluens tenyészet 20
SEJTSZÁM VÁLTOZÁS AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN 3. plató fázis 2. log fázis tápcsere nélkül sejtpusztulás 1. lag fázis 21
96 lyukú plate Ig. M termelő 4 G 12 hybridoma sejtek myeloma sejtek SZUSZPENZIÓS TENYÉSZET: nem letapadó, úszó, általában hemopoetikus vagy erősen transzformált daganatos sejtek, nem igényelnek speciális felületet. 22
23
HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA I. 1) Immunizálás 2) B sejt izolálás lépből (3) Myeloma sejtek tenyésztése (4) Myeloma sejtek és B sejtek fúziója (5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) 24
HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA II. (5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) (6) A megfelelő vonalak kiválasztása (7) in vitro (a) vagy in vivo (b) sokszorozás (8) Kinyerés 25
Antigén Myeloma sejtvonal tenyészete Sejtfúzió polietilén glikolban Lépsejtek Myeloma sejtek Hibrid sejtek szelekciója és felszaporítása A kívánt specifitású ellenanyagot termelő sejtek kiválasztása Fagyasztás Visszavétel fagyasztásból A kívánt klónok felszaporítása Tenyésztés in vitro Ellenanyag Tumorindukció Ellenanyag 26
HIBRID SEJTEK SZELEKCIÓJA HAT szelekció = hipoxantin-aminopterin-timidin médium általi szelekció Genotípus* Sejttípus HAT szelekció következménye Magyarázat TK-/TK+ Halhatatlan HAT-érzékeny myeloma sejtvonal Fuzionált hibrid sejtek Lépből izolált rövidéletű B sejtek Meghal Túlél Nem tud DNS-t szintetizálni: 1/ a funkcióvesztéses TK mutáció miatt nem képes az alternatív DNS szintézisre 2/ az aminopterin gátolja a de novo DNS szintézist Halhatatlan és a DNS szintézis helyreállított: 1/ a halhatatlanságot a myeloma sejtvonaltól kapja 2/ az alternatív DNS szintézis képessége a B sejtektől származik Meghal Korlátozott élettartam: 1/ DNS szintézisre képes, de fokozatosan kihal, mert kevésbé képesek osztódni TK: timidin kináz Aminopterin = a de novo DNS szintézis inhibitora Hipoxantin = purin származék DNS szintézis intermedierek Timidin = dezoxinukleozid * = HGPRT (hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz) mutánsok is használhatók a TK mutánsok helyett
SPECIÁLIS TENYÉSZTÉSI TÍPUSOK • Feeder layer = Tápláló sejtréteg = sejtosztódásában gátolt, de még élő sejtek használata ES sejtekhez • Tömegtenyészet (spinner flaskák, sejtgyárak, bioreaktorok stb. ) • Mikrogyön való tenyésztés • Szemi-szolid médiumban (elsősorban metilcellulóz tartalmú tápban) való tenyésztés hemopoetikus sejtekhez 28
R 1 ES sejtek fibroblaszt feeder layeren D 3 ES (embrionális ős)sejtek fibroblaszt feeder layeren 29
MIKROGYÖN TENYÉSZŐ SEJTEK Sytox orange magfestés 30
BIOREAKTOR 15 ml-ben 3 x 108 sejt tenyészthető!! 32
Sejtgyár = cell factory 10 tenyésztőtálca, 6320 cm 2 felület, 2000 ml tápfolyadék 33
SZUSZPENZIÓS TENYÉSZETEK SEJTJEINEK VIZSGÁLATA • Kenet • Vastagcsepp • Cytocentrifuga 37
VÉRKENET KÉSZÍTÉS Kenetkészítés 38
CITOCENTRIFUGÁLÁS 39
FACS hisztogramok Giemsa festett citocentrifugált sejtek Nyilak = dentritikus sejtek; nyílhegyek = monocita-szerű sejtek; inzertek = makrofágok (e), monocita-szerű sejtek (f), CD 11 b-CD 4 - sejtek (g), plasmacytoid dentritikus sejtek (h) 40
Dil-LDL felvétel Makrofág Endothel sejt Di. I-LDL = fluorokrómmal jelölt LDL (low density lipoprotein). Felvételére csak a makrofágok és az endothel sejtek képesek. 41
Antigének T sejt proliferációt fokozó hatásának kimutatása Specifikus hatás 42
Limfociták „blasztosítására” használt anyagok Növényi eredetűek MITOGÉN Bakteriális eredetű Concanavalin A (Con. A) Phytohemagglutinin (PHA) Pokeweed mitogén (PWM) Lipopoliszacharid (LPS) CÉLSEJT T sejtek T és B sejtek Sejtproliferációt indukáló hatásuk hasonló az antigének által kiváltotthoz, de aspecifikus 43
Sejtszeparálás Sűrűségradiensen l Mágneses mikrogyöngyök segítségével l Rozettaképzéssel l FACS -szal l 44
Sűrűséggradiens révén történő fehérvérsejt (limfocita, monocita) szeparálás 45
Mágneses sejt szeparálás A MACS® mikrogyöngyök olyan ellenanyaggal jelölt mágneses részecskék, amelyek a sejt felszínén lévő markerekhez kötődve azokat mágnesesen jelölik. A cél az, hogy a jelölt sejt szerkezete, funkciója, aktivitása nem változzon. A MACS® mikrogyöngyök nanopartikulumok. A képen egy. CD 8 mikrogyönggyel izolált CD 8+ T sejt látható. (A mikrogyönygyök nem láthatóak. ) Egy CD 8+ T sejt TEM-es felvétele. A nyílhegy a CD 8 mikrogyöngyöt mutatja a sejt felszínén. SEM = scanning (pásztázó) elektronmikroszkóp TEM = transzmissziós elektronmikroszkóp 46
mágneses mikrogyöngy ellenanyag mágnes sejt Mágneses jelölés Mágneses szeparálás A jelölt sejtek kinyerése Egy rövid inkubációs lépésben mikrogyöngyökkel mágnesesen jelöljük a sejteket. A sejteket MACS mágneses szeparátorba helyezett oszlopon különítjük el. Az átfolyó frakció már nem tartalmazza a jelölt sejteket. Ha az oszlopot kivesszük a mágneses szeparátorból, a Visszatartott mágnesesen jelölt sejtek egyszerűen kifolynak. Negatív szelekció Pozitív szelekció 47
MACS® szeparátor és oszlop mágnes 48
Csak negatív B-sejt negatív szelekcióra alkalmas, mert az anti-CD 3 -mal szelektált T sejtek aktiválódnak. 49
Rozettaképzés
Rozettaképzés 51
Rosette. Sep® ellenanyag koktél hozzáadása Jelölés A tetramer ellenanyag komplex keresztkötést hoz létre a nemkívánt sejtek és a vörösvértestek között 20 perc inkubálás szobahőmérsékleten Ficoll®-ra rétegzés Ficoll ® Centrifugálás Ficoll Vvt-k és nem kívánt sejtek (rozettaképzés) Kinyerés Plazma Feldúsult sejtek Feldúsult (rozettát nem képező) sejtek 52
Rosette. Sep®-pel történt NK sejt dúsítás FACS hisztogramja 53
KÖRNYEZETI KÖLCSÖNHATÁSOK SEJTTENYÉSZTÉS ALKALMAZÁSI • Fertőzések (vírus, baktérium, LEHETŐSÉGEI parazita) GENETIKA • Toxikológia • Transzformáció • Immunológia • Sejtfúzió • Karcinogenezis • Sejtciklus • Xenobiotikumok biotranszformációja INTRACELLULÁRIS AKTIVITÁS • DNS transzkripció • RNS metabolizmus BIOTECHNOLÓGIA/ • Fehérjeszintézis TISSUE ENGINEERING • Intermedier anyagcsere • Citokinek/növekedési faktorok, hormonok, ellenanyagok termeltetése • Mesterséges szövetek SEJTBIOLÓGIA • Sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatások • Génexpresszió • Sejtproliferáció • Differenciáció • Sejt-migráció, -invázió 54
Irodalom l Fülöp A. K. (Szerk. ): Immunológiai szemináriumok, 8. fejezet. Következő hét: Komplement; Immunsejtek migrációja Fülöp A. K (Szerk. ): Immunológiai szemináriumok, 4 és 9. fejezet. l Falus A, Buzás E. , Rajnavölgyi É. (Szerk. ): Az immunológia alapjai, 3. 5. fejezet l
FAKULTATÍV Példák a sejttenyésztés alkalmazási lehetőségeire 55
Differenciálódási vizsgálatok 57
i. PS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek 58
i. PS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek Jövőbeli felhasználás? 59
EX-VIVO TERÁPIA 60
Hemopoietikus őssejtek (HSC-k) módosítása 61
Az immunterápia általános stratégiája
Mesterséges szövetek l Erek – aorta l Máj l Csont Porc l Bőr l Retina l 64
Különböző korú és denzitású emberi bőrhámsejt tenyészetek 65
Emberi bőrhámsejt tenyészet felhasználásával helyreállított égési sérülés 5 évvel a pótlás után 66
TISSUE ENGINEERING Mesterséges szövetek konstruálása Biopszia Gén bejuttatás Oszteogenetikus faktor Fehérje szekréció Sejtek hozzáadása Váz= scaffold Implantáció 67
Szövetbarát scaffold, saját sejtekkel benövesztve nem immunogén 68
Bioreaktor pl. ellenanyag termelésre 69
PULZÁLÓ CARDIOMYOCYTA: BIOPACEMAKER? 70
Inzulin termeltetés differenciáltatott ES sejtekkel 71
Vírus neutralizációs teszt A He. La sejteket megöli a poliovírus (cytopathic effect) A sejteket 96 lyukú lemezen szélesztették. Az egyikben fertőzöttek voltak a sejtekben, a másikban nem. Egy idő után a sejteket kristályibolyával festették, mely csak az elő sejteket festi. Melyik lyuk tartalmazta a fertőzött sejteket? Az alsó ábrán a fertőzés előtt szérummal inkubálták a vírusokat. Ha specifikus antivirális antitets volt jelen, az gátolta a fertőzést. Neutralizációs titernek nevezik annak a legnagyobb hígításnak a reciprokát, amely még gátolja a fertőzést. Mennyi a neutralizációs titer? (egy mintát vizsgáltak 3 párhuzamos mérésben)
1 óra 5 óra 22 óra MDCK (Madine Darby canine kidney) tenyészet mikrogyöngyökön influenza fertőzés előrehaladtának kimutatása immuncitokémiával 72
Placenta Centrifugálás Magzatvíz Amnionüreg Méhfal Amniocentézis Folyadék - Összetétel elemzés Sejtek - Nem meghatározás, biokémiai és enzim vizsgálatok Sejttenyésztés Biokémiai vizsgálatok, kromoszóma analízis, DNS vizsgálatok 73
Szérum Személyzet Megelőzés Minden 6 sejttenyészetből 1 Mycoplasma fertőzött Diagnózis Ellenőrzött forrásból Kimutatás Kezelés Kiirtás Keresztfertőzés Megelőzés Tripszin Ellenőrzött forrásból 74
Mycoplasma fertőzött tenyészet sejtjei (Hoechst festés) Nem fertőzött tenyészet sejtjei (Hoeschst festés) 75
Mycoplasma fertőzött He. La tenyészet sejtjei (DAPI festés) He. La tenyészet sejtjei Mycoplasma irtás után (DAPI festés) 76
- Gamma hurok
- Ependyma sejt
- Purkinje sejt
- Növényi szövetek csoportosítása
- Reflexxel
- 2013 pearson education inc
- Memories (2013)
- Titi 2013
- Ley 1636 de 2013 subsidio de desempleo
- Hosted lync
- Summer school 2013
- Peraturan presiden ri no 60 tahun 2013
- Priscila esta subindo uma rampa a partir do ponto a
- Procurement management pmi
- Riba pow
- Peta konsep lembaga sosial kelas 7
- Layanan akademik uny
- Cs download illustrator
- Fall 2013
- Pai wed
- Psle 2013
- Kentucky building code 2013
- Writing to learn
- Iso 690:2013
- 14 november 2013
- Elizabeth bishop first death in nova scotia
- Contoh cover dokumen 1 kurikulum 2013
- Performance gap
- Vsm 2013
- Em um experimento foram utilizadas duas garrafas pet
- Website disclosures under companies act 2013
- Kurikulum perkembangan ips sd
- Legea 278/2013
- Akta 757 mesyuarat agung
- 2018 hospitality hsc exam
- Odisha r&r policy 2013
- C.m. n. 8 del 6 marzo 2013 sintesi
- Ley 1676 de 2013
- Lei 128502013
- Dial tone recovery exchange 2013
- Dpr 80 2013 fasi
- Ict 2013
- Clip art microsoft word 2013
- Agile 2013 conference
- Substansi struktur kurikulum dalam kurikulum tahun 2004
- Republic act 10627 anti bullying
- Cakupan penilaian
- Xxxxxxx 2014
- Identifikasi kesenjangan kurikulum 2013
- Salon big data 2013
- 2013 apes frq
- Maczelka csaba
- Tct 2013
- Dpr 80 2013
- Section 230-240 of companies act 2013
- Ipcc 2013
- Ertmer and newby 2013
- 326 os kormányrendelet 2013
- Ph 2013
- Odden & rochat (2004)
- Efqm 2013
- Css 2013
- 2013 pearson education inc
- Microsoft access 2013
- Enhanced basic education act of 2013
- Pusbangtendik 2013
- Inpc 2013
- Tools on the standard toolbar
- Iso/iec jtc 1/sc 27/wg 1 27001:2013
- Bimbingan konseling dalam kurikulum 2013
- Organigramme d'un centre de santé
- 2013 pearson education inc
- Microsoft word memo