SEJT S SZVETTENYSZTS OK 2013 SEJTTENYSZTS 2 A

  • Slides: 72
Download presentation
SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013)

SEJT- ÉS SZÖVETTENYÉSZTÉS (ÁOK 2013)

SEJTTENYÉSZTÉS 2 A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása ELŐNYEI: KORLÁTAI: • Jól

SEJTTENYÉSZTÉS 2 A sejtek szervezeten kívüli, in vitro (=üvegben) szaporítása ELŐNYEI: KORLÁTAI: • Jól definiált és módosítható • Nem modellezi a környezet • Meghatározott sejttípusok szervezet komplexitását • Spontán in vitro evolúció • Nagy mennyiségű sejt nyerhető • Sok sejtfunkció vizsgálható • Állatkísérletek részbeni kiváltása • Vizsgálhatók emberi sejtek 2

SEJTTENYÉSZET Növekedési mód: Típus: Monolayer • Szuszpenzió • Primer tenyészet • Sejttörzs • Sejtvonal

SEJTTENYÉSZET Növekedési mód: Típus: Monolayer • Szuszpenzió • Primer tenyészet • Sejttörzs • Sejtvonal •

Egyetlen sejt - SEM Sejtkolónia 0. 01 mm Petricsésze sejtkolóniákkal 100 mm 3

Egyetlen sejt - SEM Sejtkolónia 0. 01 mm Petricsésze sejtkolóniákkal 100 mm 3

PRIMER TENYÉSZET • A sejtek közvetlenül egy szövetdarabból származnak Először 1907 -ben alkalmazták: 1

PRIMER TENYÉSZET • A sejtek közvetlenül egy szövetdarabból származnak Először 1907 -ben alkalmazták: 1 nap Gerincvelő explantátum + nyirok A tenyészetben axonok jelennek meg! 4

Tenyésztett neuron fejlődő nyúlványokkal 5

Tenyésztett neuron fejlődő nyúlványokkal 5

SEJTTÖRZS • Primer tenyészetből ered Sejtek izolálása Szövetdarab =explantátum tápfolyadék Sejtek kiültetése sejtek tenyésztőedény

SEJTTÖRZS • Primer tenyészetből ered Sejtek izolálása Szövetdarab =explantátum tápfolyadék Sejtek kiültetése sejtek tenyésztőedény • A letapadt sejtek osztódnak, növekednek és monolayert képeznek • Tápfolyadék szükséges a növekedéshez • 50 -100 osztódás után a sejtek meghalnak (Hayflick szabály) 6

SEJTVONAL • Halhatatlan, immortalizált • Genetikai hibák (aneuploidia) • Kontaktgátlás elvesztése • Korlátlan növekedés

SEJTVONAL • Halhatatlan, immortalizált • Genetikai hibák (aneuploidia) • Kontaktgátlás elvesztése • Korlátlan növekedés • Csökkent adhéziójú, esetleg szuszpenziós tenyészet • Egérben tumort képezhet • Vagy transzformálódott sejtekből ered (spontán vagy karcinogének, vírusok, besugárzás révén) pl. 3 T 3 21 F vonal, CHO • Vagy tumorból származik pl. He. LA vonal - méhnyakrákból származó (Henrietta Lacks, 1951) 7

Normális Kontaktgátlás van Vírus transzformált Egymásra növő, felgömbölyödő sejtek 8

Normális Kontaktgátlás van Vírus transzformált Egymásra növő, felgömbölyödő sejtek 8

normális sejtek SEM transzformált sejtek 9

normális sejtek SEM transzformált sejtek 9

10

10

He. La monolayer sejttenyészet Egymásra nőtt sejtek A sejtmorfológia változik a denzitással!! 11

He. La monolayer sejttenyészet Egymásra nőtt sejtek A sejtmorfológia változik a denzitással!! 11

OLDOTT ANYAGOK • Tápfolyadék • Szérum • Hormonok • Növekedési faktorok • Letapadási faktorok

OLDOTT ANYAGOK • Tápfolyadék • Szérum • Hormonok • Növekedési faktorok • Letapadási faktorok STERILITÁS + OPTIMÁLIS KÖRNYEZETI FELTÉTELEK, MÁTRIX KÖLCSÖNHATÁSOK • Tenyésztő felület pl. műanyag, üveg, membránok, mikrogyöngyök • Bevonat (coat) pl. kollagén, zselatin, feeder layer (tápláló sejtréteg) Matrigel, Biomatrix SEJTEK ÉS SEJTKÖLCSÖNHATÁSOK • Sejtkölcsönhatás: homológ = sejt denzitás heterológ = együtttenyésztés (co-culture) • Metabolitok és termékek autokrin és parakrin hatás • Anyagcsere ráta FIZIKAI PARAMÉTEREK • Hőmérséklet • p. H (indikátor+puffer) • Oxigén/Széndioxid konc. • Páratartalom • Ozmolaritás • Statikus vagy dinamikus tenyészet 12

SEJTSZÁMOLÁS • Mit? Összsejtszámot Ø Csak az élő sejteket – pl. tripánkék exklúzió után

SEJTSZÁMOLÁS • Mit? Összsejtszámot Ø Csak az élő sejteket – pl. tripánkék exklúzió után Ø • Mivel? Hemocitométerrel (Általában Bürker-kamrával) Ø Automatizált sejtszámlálóval (pl. hematológiai citométer vagy FACS stb. ) Ø 14

Automatizált sejtszámlálás A mérés alapja: vagy impedancia meghatározás vagy fényszóródáson alapuló meghatározás

Automatizált sejtszámlálás A mérés alapja: vagy impedancia meghatározás vagy fényszóródáson alapuló meghatározás

Különböző típusú hemocitométerek Neubauer Tökéletesített Neubauer Thoma Burker Módosított Fuchs-Rosenthal 16

Különböző típusú hemocitométerek Neubauer Tökéletesített Neubauer Thoma Burker Módosított Fuchs-Rosenthal 16

TRIPÁNKÉK EXKLUZIÓ (KIZÁRÁS) = CSAK A HALOTT SEJTEK FESTŐDNEK Élő sejt Halott sejtek H

TRIPÁNKÉK EXKLUZIÓ (KIZÁRÁS) = CSAK A HALOTT SEJTEK FESTŐDNEK Élő sejt Halott sejtek H H 17

1 mm Az 1 mm 2 -en számolandó sejtek 18

1 mm Az 1 mm 2 -en számolandó sejtek 18

A 3 vonallal határolt négyzet össztérfogata = 1 mm 2 x 0, 1 mm

A 3 vonallal határolt négyzet össztérfogata = 1 mm 2 x 0, 1 mm = 0, 1 mm 3 = 10 -4 ml (= 0, 1 cm x 0, 01 cm =10 -4 cm 3 = 10 -4 ml) 19

A SEJTSZÁM VÁLTOZÁSA AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN Konfluens tenyészet 20

A SEJTSZÁM VÁLTOZÁSA AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN Konfluens tenyészet 20

SEJTSZÁM VÁLTOZÁS AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN 3. plató fázis 2. log fázis tápcsere nélkül sejtpusztulás

SEJTSZÁM VÁLTOZÁS AZ IDŐ FÜGGVÉNYÉBEN 3. plató fázis 2. log fázis tápcsere nélkül sejtpusztulás 1. lag fázis 21

96 lyukú plate Ig. M termelő 4 G 12 hybridoma sejtek myeloma sejtek SZUSZPENZIÓS

96 lyukú plate Ig. M termelő 4 G 12 hybridoma sejtek myeloma sejtek SZUSZPENZIÓS TENYÉSZET: nem letapadó, úszó, általában hemopoetikus vagy erősen transzformált daganatos sejtek, nem igényelnek speciális felületet. 22

23

23

HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA I. 1) Immunizálás 2) B sejt izolálás lépből (3) Myeloma sejtek tenyésztése

HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA I. 1) Immunizálás 2) B sejt izolálás lépből (3) Myeloma sejtek tenyésztése (4) Myeloma sejtek és B sejtek fúziója (5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) 24

HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA II. (5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) (6) A megfelelő vonalak kiválasztása (7) in

HIBRIDÓMA LÉTREHOZÁSA II. (5) Sejtvonalak elkülönítése (klónozás) (6) A megfelelő vonalak kiválasztása (7) in vitro (a) vagy in vivo (b) sokszorozás (8) Kinyerés 25

Antigén Myeloma sejtvonal tenyészete Sejtfúzió polietilén glikolban Lépsejtek Myeloma sejtek Hibrid sejtek szelekciója és

Antigén Myeloma sejtvonal tenyészete Sejtfúzió polietilén glikolban Lépsejtek Myeloma sejtek Hibrid sejtek szelekciója és felszaporítása A kívánt specifitású ellenanyagot termelő sejtek kiválasztása Fagyasztás Visszavétel fagyasztásból A kívánt klónok felszaporítása Tenyésztés in vitro Ellenanyag Tumorindukció Ellenanyag 26

HIBRID SEJTEK SZELEKCIÓJA HAT szelekció = hipoxantin-aminopterin-timidin médium általi szelekció Genotípus* Sejttípus HAT szelekció

HIBRID SEJTEK SZELEKCIÓJA HAT szelekció = hipoxantin-aminopterin-timidin médium általi szelekció Genotípus* Sejttípus HAT szelekció következménye Magyarázat TK-/TK+ Halhatatlan HAT-érzékeny myeloma sejtvonal Fuzionált hibrid sejtek Lépből izolált rövidéletű B sejtek Meghal Túlél Nem tud DNS-t szintetizálni: 1/ a funkcióvesztéses TK mutáció miatt nem képes az alternatív DNS szintézisre 2/ az aminopterin gátolja a de novo DNS szintézist Halhatatlan és a DNS szintézis helyreállított: 1/ a halhatatlanságot a myeloma sejtvonaltól kapja 2/ az alternatív DNS szintézis képessége a B sejtektől származik Meghal Korlátozott élettartam: 1/ DNS szintézisre képes, de fokozatosan kihal, mert kevésbé képesek osztódni TK: timidin kináz Aminopterin = a de novo DNS szintézis inhibitora Hipoxantin = purin származék DNS szintézis intermedierek Timidin = dezoxinukleozid * = HGPRT (hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz) mutánsok is használhatók a TK mutánsok helyett

SPECIÁLIS TENYÉSZTÉSI TÍPUSOK • Feeder layer = Tápláló sejtréteg = sejtosztódásában gátolt, de még

SPECIÁLIS TENYÉSZTÉSI TÍPUSOK • Feeder layer = Tápláló sejtréteg = sejtosztódásában gátolt, de még élő sejtek használata ES sejtekhez • Tömegtenyészet (spinner flaskák, sejtgyárak, bioreaktorok stb. ) • Mikrogyön való tenyésztés • Szemi-szolid médiumban (elsősorban metilcellulóz tartalmú tápban) való tenyésztés hemopoetikus sejtekhez 28

R 1 ES sejtek fibroblaszt feeder layeren D 3 ES (embrionális ős)sejtek fibroblaszt feeder

R 1 ES sejtek fibroblaszt feeder layeren D 3 ES (embrionális ős)sejtek fibroblaszt feeder layeren 29

MIKROGYÖN TENYÉSZŐ SEJTEK Sytox orange magfestés 30

MIKROGYÖN TENYÉSZŐ SEJTEK Sytox orange magfestés 30

BIOREAKTOR 15 ml-ben 3 x 108 sejt tenyészthető!! 32

BIOREAKTOR 15 ml-ben 3 x 108 sejt tenyészthető!! 32

Sejtgyár = cell factory 10 tenyésztőtálca, 6320 cm 2 felület, 2000 ml tápfolyadék 33

Sejtgyár = cell factory 10 tenyésztőtálca, 6320 cm 2 felület, 2000 ml tápfolyadék 33

SZUSZPENZIÓS TENYÉSZETEK SEJTJEINEK VIZSGÁLATA • Kenet • Vastagcsepp • Cytocentrifuga 37

SZUSZPENZIÓS TENYÉSZETEK SEJTJEINEK VIZSGÁLATA • Kenet • Vastagcsepp • Cytocentrifuga 37

VÉRKENET KÉSZÍTÉS Kenetkészítés 38

VÉRKENET KÉSZÍTÉS Kenetkészítés 38

CITOCENTRIFUGÁLÁS 39

CITOCENTRIFUGÁLÁS 39

FACS hisztogramok Giemsa festett citocentrifugált sejtek Nyilak = dentritikus sejtek; nyílhegyek = monocita-szerű sejtek;

FACS hisztogramok Giemsa festett citocentrifugált sejtek Nyilak = dentritikus sejtek; nyílhegyek = monocita-szerű sejtek; inzertek = makrofágok (e), monocita-szerű sejtek (f), CD 11 b-CD 4 - sejtek (g), plasmacytoid dentritikus sejtek (h) 40

Dil-LDL felvétel Makrofág Endothel sejt Di. I-LDL = fluorokrómmal jelölt LDL (low density lipoprotein).

Dil-LDL felvétel Makrofág Endothel sejt Di. I-LDL = fluorokrómmal jelölt LDL (low density lipoprotein). Felvételére csak a makrofágok és az endothel sejtek képesek. 41

Antigének T sejt proliferációt fokozó hatásának kimutatása Specifikus hatás 42

Antigének T sejt proliferációt fokozó hatásának kimutatása Specifikus hatás 42

Limfociták „blasztosítására” használt anyagok Növényi eredetűek MITOGÉN Bakteriális eredetű Concanavalin A (Con. A) Phytohemagglutinin

Limfociták „blasztosítására” használt anyagok Növényi eredetűek MITOGÉN Bakteriális eredetű Concanavalin A (Con. A) Phytohemagglutinin (PHA) Pokeweed mitogén (PWM) Lipopoliszacharid (LPS) CÉLSEJT T sejtek T és B sejtek Sejtproliferációt indukáló hatásuk hasonló az antigének által kiváltotthoz, de aspecifikus 43

Sejtszeparálás Sűrűségradiensen l Mágneses mikrogyöngyök segítségével l Rozettaképzéssel l FACS -szal l 44

Sejtszeparálás Sűrűségradiensen l Mágneses mikrogyöngyök segítségével l Rozettaképzéssel l FACS -szal l 44

Sűrűséggradiens révén történő fehérvérsejt (limfocita, monocita) szeparálás 45

Sűrűséggradiens révén történő fehérvérsejt (limfocita, monocita) szeparálás 45

Mágneses sejt szeparálás A MACS® mikrogyöngyök olyan ellenanyaggal jelölt mágneses részecskék, amelyek a sejt

Mágneses sejt szeparálás A MACS® mikrogyöngyök olyan ellenanyaggal jelölt mágneses részecskék, amelyek a sejt felszínén lévő markerekhez kötődve azokat mágnesesen jelölik. A cél az, hogy a jelölt sejt szerkezete, funkciója, aktivitása nem változzon. A MACS® mikrogyöngyök nanopartikulumok. A képen egy. CD 8 mikrogyönggyel izolált CD 8+ T sejt látható. (A mikrogyönygyök nem láthatóak. ) Egy CD 8+ T sejt TEM-es felvétele. A nyílhegy a CD 8 mikrogyöngyöt mutatja a sejt felszínén. SEM = scanning (pásztázó) elektronmikroszkóp TEM = transzmissziós elektronmikroszkóp 46

mágneses mikrogyöngy ellenanyag mágnes sejt Mágneses jelölés Mágneses szeparálás A jelölt sejtek kinyerése Egy

mágneses mikrogyöngy ellenanyag mágnes sejt Mágneses jelölés Mágneses szeparálás A jelölt sejtek kinyerése Egy rövid inkubációs lépésben mikrogyöngyökkel mágnesesen jelöljük a sejteket. A sejteket MACS mágneses szeparátorba helyezett oszlopon különítjük el. Az átfolyó frakció már nem tartalmazza a jelölt sejteket. Ha az oszlopot kivesszük a mágneses szeparátorból, a Visszatartott mágnesesen jelölt sejtek egyszerűen kifolynak. Negatív szelekció Pozitív szelekció 47

MACS® szeparátor és oszlop mágnes 48

MACS® szeparátor és oszlop mágnes 48

Csak negatív B-sejt negatív szelekcióra alkalmas, mert az anti-CD 3 -mal szelektált T sejtek

Csak negatív B-sejt negatív szelekcióra alkalmas, mert az anti-CD 3 -mal szelektált T sejtek aktiválódnak. 49

Rozettaképzés

Rozettaképzés

Rozettaképzés 51

Rozettaképzés 51

Rosette. Sep® ellenanyag koktél hozzáadása Jelölés A tetramer ellenanyag komplex keresztkötést hoz létre a

Rosette. Sep® ellenanyag koktél hozzáadása Jelölés A tetramer ellenanyag komplex keresztkötést hoz létre a nemkívánt sejtek és a vörösvértestek között 20 perc inkubálás szobahőmérsékleten Ficoll®-ra rétegzés Ficoll ® Centrifugálás Ficoll Vvt-k és nem kívánt sejtek (rozettaképzés) Kinyerés Plazma Feldúsult sejtek Feldúsult (rozettát nem képező) sejtek 52

Rosette. Sep®-pel történt NK sejt dúsítás FACS hisztogramja 53

Rosette. Sep®-pel történt NK sejt dúsítás FACS hisztogramja 53

KÖRNYEZETI KÖLCSÖNHATÁSOK SEJTTENYÉSZTÉS ALKALMAZÁSI • Fertőzések (vírus, baktérium, LEHETŐSÉGEI parazita) GENETIKA • Toxikológia •

KÖRNYEZETI KÖLCSÖNHATÁSOK SEJTTENYÉSZTÉS ALKALMAZÁSI • Fertőzések (vírus, baktérium, LEHETŐSÉGEI parazita) GENETIKA • Toxikológia • Transzformáció • Immunológia • Sejtfúzió • Karcinogenezis • Sejtciklus • Xenobiotikumok biotranszformációja INTRACELLULÁRIS AKTIVITÁS • DNS transzkripció • RNS metabolizmus BIOTECHNOLÓGIA/ • Fehérjeszintézis TISSUE ENGINEERING • Intermedier anyagcsere • Citokinek/növekedési faktorok, hormonok, ellenanyagok termeltetése • Mesterséges szövetek SEJTBIOLÓGIA • Sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatások • Génexpresszió • Sejtproliferáció • Differenciáció • Sejt-migráció, -invázió 54

Irodalom l Fülöp A. K. (Szerk. ): Immunológiai szemináriumok, 8. fejezet. Következő hét: Komplement;

Irodalom l Fülöp A. K. (Szerk. ): Immunológiai szemináriumok, 8. fejezet. Következő hét: Komplement; Immunsejtek migrációja Fülöp A. K (Szerk. ): Immunológiai szemináriumok, 4 és 9. fejezet. l Falus A, Buzás E. , Rajnavölgyi É. (Szerk. ): Az immunológia alapjai, 3. 5. fejezet l

FAKULTATÍV Példák a sejttenyésztés alkalmazási lehetőségeire 55

FAKULTATÍV Példák a sejttenyésztés alkalmazási lehetőségeire 55

Differenciálódási vizsgálatok 57

Differenciálódási vizsgálatok 57

i. PS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek 58

i. PS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek 58

i. PS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek Jövőbeli felhasználás? 59

i. PS sejtek = induced pluripotent stem /indukált pluripotens ős-/ sejtek Jövőbeli felhasználás? 59

EX-VIVO TERÁPIA 60

EX-VIVO TERÁPIA 60

Hemopoietikus őssejtek (HSC-k) módosítása 61

Hemopoietikus őssejtek (HSC-k) módosítása 61

Az immunterápia általános stratégiája

Az immunterápia általános stratégiája

Mesterséges szövetek l Erek – aorta l Máj l Csont Porc l Bőr l

Mesterséges szövetek l Erek – aorta l Máj l Csont Porc l Bőr l Retina l 64

Különböző korú és denzitású emberi bőrhámsejt tenyészetek 65

Különböző korú és denzitású emberi bőrhámsejt tenyészetek 65

Emberi bőrhámsejt tenyészet felhasználásával helyreállított égési sérülés 5 évvel a pótlás után 66

Emberi bőrhámsejt tenyészet felhasználásával helyreállított égési sérülés 5 évvel a pótlás után 66

TISSUE ENGINEERING Mesterséges szövetek konstruálása Biopszia Gén bejuttatás Oszteogenetikus faktor Fehérje szekréció Sejtek hozzáadása

TISSUE ENGINEERING Mesterséges szövetek konstruálása Biopszia Gén bejuttatás Oszteogenetikus faktor Fehérje szekréció Sejtek hozzáadása Váz= scaffold Implantáció 67

Szövetbarát scaffold, saját sejtekkel benövesztve nem immunogén 68

Szövetbarát scaffold, saját sejtekkel benövesztve nem immunogén 68

Bioreaktor pl. ellenanyag termelésre 69

Bioreaktor pl. ellenanyag termelésre 69

PULZÁLÓ CARDIOMYOCYTA: BIOPACEMAKER? 70

PULZÁLÓ CARDIOMYOCYTA: BIOPACEMAKER? 70

Inzulin termeltetés differenciáltatott ES sejtekkel 71

Inzulin termeltetés differenciáltatott ES sejtekkel 71

Vírus neutralizációs teszt A He. La sejteket megöli a poliovírus (cytopathic effect) A sejteket

Vírus neutralizációs teszt A He. La sejteket megöli a poliovírus (cytopathic effect) A sejteket 96 lyukú lemezen szélesztették. Az egyikben fertőzöttek voltak a sejtekben, a másikban nem. Egy idő után a sejteket kristályibolyával festették, mely csak az elő sejteket festi. Melyik lyuk tartalmazta a fertőzött sejteket? Az alsó ábrán a fertőzés előtt szérummal inkubálták a vírusokat. Ha specifikus antivirális antitets volt jelen, az gátolta a fertőzést. Neutralizációs titernek nevezik annak a legnagyobb hígításnak a reciprokát, amely még gátolja a fertőzést. Mennyi a neutralizációs titer? (egy mintát vizsgáltak 3 párhuzamos mérésben)

1 óra 5 óra 22 óra MDCK (Madine Darby canine kidney) tenyészet mikrogyöngyökön influenza

1 óra 5 óra 22 óra MDCK (Madine Darby canine kidney) tenyészet mikrogyöngyökön influenza fertőzés előrehaladtának kimutatása immuncitokémiával 72

Placenta Centrifugálás Magzatvíz Amnionüreg Méhfal Amniocentézis Folyadék - Összetétel elemzés Sejtek - Nem meghatározás,

Placenta Centrifugálás Magzatvíz Amnionüreg Méhfal Amniocentézis Folyadék - Összetétel elemzés Sejtek - Nem meghatározás, biokémiai és enzim vizsgálatok Sejttenyésztés Biokémiai vizsgálatok, kromoszóma analízis, DNS vizsgálatok 73

Szérum Személyzet Megelőzés Minden 6 sejttenyészetből 1 Mycoplasma fertőzött Diagnózis Ellenőrzött forrásból Kimutatás Kezelés

Szérum Személyzet Megelőzés Minden 6 sejttenyészetből 1 Mycoplasma fertőzött Diagnózis Ellenőrzött forrásból Kimutatás Kezelés Kiirtás Keresztfertőzés Megelőzés Tripszin Ellenőrzött forrásból 74

Mycoplasma fertőzött tenyészet sejtjei (Hoechst festés) Nem fertőzött tenyészet sejtjei (Hoeschst festés) 75

Mycoplasma fertőzött tenyészet sejtjei (Hoechst festés) Nem fertőzött tenyészet sejtjei (Hoeschst festés) 75

Mycoplasma fertőzött He. La tenyészet sejtjei (DAPI festés) He. La tenyészet sejtjei Mycoplasma irtás

Mycoplasma fertőzött He. La tenyészet sejtjei (DAPI festés) He. La tenyészet sejtjei Mycoplasma irtás után (DAPI festés) 76