SCHIZOMICETI BATTERI Microrganismi unicellulari pi piccoli complessi capaci

SCHIZOMICETI BATTERI • Microrganismi unicellulari, più piccoli complessi, capaci di autoreplicazione ( ca 1µ) e meno – Thiomargarita nabimiensis 10 -300 µm • Procarioti • DNA ed RNA • Parete batterica eccetto micoplasmi e batteri che vivono in habitat ad alta conc salina • • Replicazione per scissione binaria Molto abbondanti in natura cicli biologici Per lo più autonomi Simbiosi con altre forme di vita – parassiti facoltativi, parassiti obbligati • patogeni (virulenza e patogenicità) 1

Metodi di studio in microbiologia Tradizionali visualizzazione microscopia • Gram, Ziehl-Neelsen forma, dimensioni, disposizione, • caratteristiche tintoriali IF forma, dimensioni, disposizione, sede intracellulare, identificazione coltivazione • terreni artificiali in vitro – agarizzati colonie coltura pura – brodi sospensione cellulare • in vivo (animali, da esperimento, colture cellulari) analisi antigene Innovativi metodiche biomolecolari • analisi proteine, lipidi, acidi nucleici 2

Batteri colorazione di Gram pos blu-violetto Gram neg rossi 3

Batteri • Eccetto se parassiti obbligati, si possono coltivare su terreni artificiali, solidi o liquidi • esigenze nutrizionali • temperatura ottimale • tensione O 2 • aerobiosi, microaerofilia, anaerobiosi 4

Anaerobi Batteri incapaci di svolgere in presenza di ossigeno i processi catabolici necessari alla produzione di energia, ATP, da utilizzare nelle reazioni anaboliche, biosintetiche Meccanismi molteplici • Catalasi • scindono perossidi formati in presenza di ossigeno • Superossido-dismutasi • protezione dall’azione nociva del radicale superossido libero Stretti -O 2 0. 5%- e meno stretti -O 2 2 -8%- Gram pos Clostridium Gram neg Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Treponema, … 5

Schema di cellula procariota 6

Batteri Il citoplasma batterico spicca per l’alta concentrazione salina • Salvo eccezioni, i batteri si trovano in ambiente ipo-osmotico richiamo di acqua lisi osmotica I batteri devono resistere alla lisi osmotica 7

Batteri Membrana citoplasmatica • Simile per struttura e funzioni alla membrana delle cellule eucariotiche • barriera di permeabilità • trasporto di soluti • Assenza di steroli • Maggior contenuto proteico • proteine non glicosilate • Sede di funzioni appannaggio, nella cellula eucariotica, di organuli intracitoplasmatici • sistema trasporto elettroni 8

Strutture ACCESSORIE Capsula [strato mucoso] Øprotezione Appendici filiformi • Pili, Fimbrie Øadesività • Ciglia, flagelli, filamenti assiali [o endoflagelli] Ømovimento Granuli 9

Capsule e strati mucosi • Esterni alla parete • ben strutturati: capsula • non ben strutturati: strato mucoso, glycocalix • Polimerici, per lo più polisaccaridici • talvolta poliaminoacidici (non proteine) • Tendenza a essere persi nei passaggi in coltura • Importanti se fattori di virulenza • Antigeni anticorpi protettivi 10

Pili (fimbrie) Proiezioni filiformi dalla superficie • Pili sessuali • coniugazione ricombinazione genetica • Adesine • importanti se fattori di virulenza • antigeni anticorpi protettivi 11

Parete batterica Involucro rigido al di sopra della membrana citoplasmatica • Anti lisi osmotica • Forma • Bastoncini, cocchi, a virgola, a spirale • Caratteristiche tintoriali • Gram, alcool-acido resistenza • Virulenza e patogenicità • Sede di antigeni 12

Peptidoglicano o Mureina componente strutturale della parete • singola macromolecola • lunghissimo polimero lineare, stabilizzato da fitti legami trasversi • avvolge la cellula, formando un astuccio rigido e resistente Ødetermina la forma Øimpedisce il rigonfiamento 13

Peptidoglicano o Mureina Il monomero • Due aminozuccheri (NAM e NAG) legati da legame glucosidico • Polipeptide (4 o 5 aa) legato al NAM 14

Peptidoglicano o Mureina 15

Peptidoglicano Sintesi 16

Peptidoglicano Sintesi 17

Peptidoglicano Sintesi 18

Parete batterica Ø La parete batterica nella sua componente del peptidoglicano costituisce il bersaglio di molti antibiotici • Tali antibiotici agiscono impedendo la sintesi del peptidoglicano • Antibiotici diversi agiscono su momenti diversi del processo sintetico • assemblaggio finale transpeptidizzazione • passaggio trans-membrana • sintesi del monomero 19

Parete Gram neg e Gram pos 20

VIRULENZA probabilità che • si instauri il rapporto infettivo PATOGENICITA’ probabilità che • si instauri la malattia 21

Virulenza caratteristica propria e qualificante degli agenti di infezione in quanto tali Capacità di superare le difese dell’ospite Probabilità che si instauri il rapporto infettivo • Variabile estrinseca o relativa –dipende dall’ospite che si considera • Variabile quantitativa –misurabile Dose Infettante 50 • Generalmente multifattoriale –fattori di virulenza cellulari o solubili –antigeni risposta protettiva • Correlata alla patogenicità 22

Fattori di virulenza • Adesine (pili o fimbrie, capsule) • Fattori antifagocitari – uccisione del fagocita (leucocidine) – evasione (capsula) – resistenza al killing intrafagocitario Immunità innata • Invasine • Proteine chelanti il Fe (IBP), siderofori • Fattori istotossici (proteasi) • …… • s. Ig. A proteasi • Mimetismo e variabilità antigene acquisita 23

Patogenicità Capacità di provocare il danno Probabilità che si instauri la malattia • Variabile estrinseca o relativa – dipende dall’ospite che si considera • Variabile quantitativa – misurabile Dose 50 • Generalmente multifattoriale – fattori di patogenicità cellulari o solubili – antigeni risposta protettiva • Non strettamente correlata alla virulenza 24

Patogenesi Replicazione intensa • risposta flogistica Tossicità • mediatori della flogosi • alterazioni funzionali Terapia Prevenzione – sintesi proteica – rilascio neurotrasmettitori – equilibrio idrico 25

Patogenicità microbica prevalentemente, ma non esclusivamente, infettiva Patogenicità svincolata dalla virulenza • alcuni agenti producono delle tossine così potenti che il danno e la patologia possono essere forti e gravi anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo o di reazione infiammatoria • tetano; botulismo classico; colera Ø patologia anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo 26

Fattori di patogenicità classicamente rappresentati dalle esotossine • • • tossine rilasciate da Gram pos e Gram neg proteiche buoni immunogeni Vaccini specie-specifiche tossine binarie, citolisine, superantigeni Sieri alcune molto potenti endotossina componente membrana esterna Gram neg • LPS • non buon immunogeno • non specie-specifico • tossicità indiretta rilascio di mediatori cellulari • non molto potente 27

Esotossine • c-AMP alterazione contenuto intracellulare – tossina colerica diarrea – tossina pertussica • Sintesi proteica inibizione – tossina difterica • Citoscheletro alterazioni funzioni – tossina C. difficile • Rilascio di neurotrasmettitori interferenza – tossina tetanica paralisi spastica – tossina botulinica paralisi flaccida • Superficie cellulare – Citolisine • Linfociti T attivazione policlonale – superantigeni stafilococcici 28

LPS endotossina 29

Patogenicità microbica prevalentemente, ma non esclusivamente, infettiva Patogenicità svincolata dalla virulenza • alcuni agenti producono delle tossine così potenti che il danno e la patologia possono essere forti e gravi anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo o di reazione infiammatoria • tetano; botulismo classico; colera Ø patologia anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo 30

Disinfectant Selection Table 31

La spora batterica • Citoplasma povero di H 2 O • Dipicolinato di Calcio • Rivestimenti costituiti da proteine ricche in legami disulfidrici 32

La spora batterica • Forma di resistenza – temperature estreme – agenti chimico-fisici di disinfezione – mancanza di acqua • Metabolicamente inattiva • Differenziazione della cellula batterica • Caratteristica di alcuni generi – Bacillus, Clostridium • Non legata alla replicazione batterica – cellula vegetativa spora cellula vegetativa • La spora infetta Ø non in quanto tale Ø deve ritornare a cellula vegetativa 33

Cinetica di sviluppo di una popolazione batterica Conta batterica Ø Concentrazione Cellule totali batterica rispetto • camera contaglobuli al tempo • stime correlate col numero di cellule 1. Trapianto in terreni liquido 2. A tempi diversi aliquota fissa 3. Conta – concentrazione proteica – turbidimetria • proprietà ottiche delle sospensioni e loro dipendenza dal numero di particelle Cellule vive • subcoltivazione in agar conta colonie una colonia una cellula 34

Fasi della crescita batterica • Latenza – numero costante – attività di sintesi enzimi per utilizzazione terreno • enzimi costitutivi/adattativi • Crescita logaritmica – aumento esponenziale – attività sintetica al max • Stasi – numero costante o in diminuizione – esaurimento fattore limitante lo sviluppo • conte totali vs conte vitali Differenze fisiologiche in rapporto alla fase di sviluppo sensibilità agli antibiotici, ai fagi; …. 35 Øinfezione acuta vs infezione cronica

Specie batterica: insieme di ceppi con alcune caratteristiche a comune che li differenziano da altri ceppi Tipo Specie Genere Famiglia Ordine Classe Philum Regno Denominazione linneiana Genere e specie • • • Escherichia coli Treponema pallidum, Treponema denticola Clostridium tetani, Clostridium botulinum Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis Helicobacter pylori Differenze al di sotto della specie tipi • • • E. coli O 157 H 7 Str. pyogenes M 12 Str. mutans c 36

I farmaci antibatterici Prodotti naturali di miceti o batteri, antibiotici ( competizione vitale) o composti sintetici, chemioterapici • che uccidono [battericidi] o inibiscono [batteriostatici] la crescita dei batteri • MBC Concentrazione Minima Battericida • MIC Concentrazione Minima Inibente 37

I farmaci antibatterici bersaglio e meccanismi azione Acidi nucleici • sintesi precursori acidi folici sulfamidici, trimethroprim • sintesi DNA novobiocina, chinolonici, metronidazolo • sintesi RNA rifampicina Parete • sintesi peptiglicano – sintesi dei precursori cicloserina – passaggio trans-membrana bacitracina ristocetina – assemblaggio –lattamici, vancomicina • sintesi composti tipici dei micobatteri – acidi micolici isoniazide – arabinogalattano etanbutolo Sintesi proteica – subunità 30 S aminoglicosidi, tetracicline – subunità 50 S macrolidi, cloramfenicolo – fattori extraribosomiali acido fusidico Membrana membrana esterna Gram neg • disorganizzazione polimixine 38

I farmaci antibatterici farmaco-resistenza Resistenza innata o intrinseca • • caratteristica di un gruppo, specie, genere nota a priori Meccanismi • assenza del bersaglio – lattamici, altri micoplasmi • ostacolo alla entrata nella cellula batterica – aminoglicosidi O 2 -dipendente anaerobi – vancomicina gram-neg • non attivazione nella cellula batterica – metronidazolo aerobi Resistenza estrinseca o acquisita • cambiamento del genoma • pochi ceppi di un gruppo, specie, genere selezione non nota a priori sotto i nostri occhi • – evoluzione Meccanismi • sul batterio – modificazione del bersaglio – impedimento al raggiungimento del bersaglio – aumento dell’efflusso • sul farmaco – modificazione enzimatica – distruzione enzimatica 39

I farmaci antibatterici Antibiogramma • saggio in vitro per guidare la terapia antibatterica • il ceppo isolato viene saggiato contro un pannello di antibiotici – verranno non impiegati quello/quei farmaci verso i quali si ha resistenza – per gli altri si sceglierà quello più adatto • • sede di infezione e farmacocinetica condizioni del soggetto costo tossicità 40

Antibiogramma - M. diffusione in piastra Sensibile Multiresistente 41

Adattabilità ad un nuovo ambiente • • ambiente inanimato ambiente animato sedi diverse nell’ospite Regolazione • Sequenza DNA – amplificazione del gene – riarrangiamento del gene espressione coordinata dei fattori di virulenza e • Trascrizione patogenicità – attivatori – repressori • controllata da fattori ambientali • Post-trascrizione – temperatura, fonti carbonio, osmolatrità, conc Fe, nutrienti … – modificazione covalente – clivaggio proteolitico – legame a proteine della cellula ospite 42

Genoma batterico informazione replicazione sincrona con divisione cellulare • Cromosoma unico e Unità genetiche accessorie (plasmidi) – assenza di istoni – unità trascrizionali multicistroniche – quasi tutta la sequenza per • codificazione proteine • regolazione trascrizione • Aploidia – espressione fenotipica immediata di un qualsiasi cambiamento – controllo • attivazione/disattivazione promoters 43

Batteri Plasmidi • DNA extracromosomico • copie multiple • informazione per • fattori di virulenza & patogenicità • antibiotico-resistenza…. • trasferibili • coniugazione batterica 44

Adattabilità variazioni fenotipiche • tutta la popolazione si adatta fisiologicamente al nuovo ambiente nell’ambito del potenziale genomico – cambia il fenotipo non il genotipo espressione del gene/i variazioni genotipiche • la cellula mutata viene selezionata perché meglio si adatta all’ambiente – mutazione – ricombinazione • trasformazione, coniugazione, transduzione elementi genetici di trasposizione 45