Saggio di ibridazione Il saggio di ibridazione degli

Saggio di ibridazione Il saggio di ibridazione degli acidi nucleici richiede la formazione di eteroduplex tra sonde marcate a singolo filamento e sequenze complementari all’interno di un bersaglio molecolare

Origine e caratteristiche delle sonde utilizzate nelle ibridazioni di acidi nucleici

Tipi di saggi di ibridazione Standard Inversi ü Dot-blot inverso üSouthern Blot ü Microarray di DNA ü Northern Blot ü Microarray di oligonucleotidi ü Ibridazione in situ ü Colony blot ü Plaque lift ü saggio di ibridazione su cloni disposti in griglie

Dot-blot con oligonucleotidi allele-specifici (ASO) puo’ identificare gli individui con la mutazione che determina l’anemia falciforme

Allele-Specific Oligonucleotide (ASO) test per la Fibrosi Cistica La Fibrosi Cistica (CF) e’ una malattia autosomica recessiva, caratterizzata dall’ accumulo di muchi nei polmoni. La nascita di una figlia affetta (II-1) da due genitori non affetti indica che entrambi sono eterozigoti. I due fratelli non affetti sono portatori di CF? L’allele piu’ comune di CF, D 508, contiene una delezione di 3 bp. Due oligonucleotidi allele specifici (ASO) sono utilizzati in esperimenti di Dot-Blot su DNA genomico degli individui della famiglia spottati in due file su un filtro. Ogni fila del filtro e’ ibridato con ciascun ASO. L’avvenuta ibridazione (indicata con la presenza di uno spot sul filtro) indica la presenza dell’allele corrispondente.

Reverse dot-blot hybridisation uses membrane-bound allele-specific oligonucleotide probes that hybridise to the complementary sequence of the PCR product prepared using patient DNA as the starting template. In this format, multiple pairs of normal and mutant allele-specific oligonucleotides can be placed on a small strip of membrane. Hybridisation with PCR-amplified b -globin gene DNA will detect any of the mutations screened in a single procedure. Up to 20 -30 mutations have indeed been screened in one single step.

Southern Blot

Esempio: verificare la trasformazione e l’incorporazione di un gene in diverse popolazioni cellulari DNA genomici digeriti con enzima Eco RI

Applicazioni del Southern Blot (1) v individuazione diretta di mutazioni puntiformi patogene per mezzo del mappaggio di restrizione (es. mutazione A T nel gene della beta-globina nell’anemia falciforme) v individuazione di RFLP convenzionali

Applicazioni del Southern Blot (2) v fingerprinting v individuazione delle delezioni geniche per mezzo del mappaggio di restrizione Esempio 1: Deficit della 21 -idrossilasi Esempio 2: N D

Northern Blot

. . . puo’ essere utile per: • studiare la tessuto-specificita’ di un gene; • quantificare il livello di espressione.

Colony hybridization Questo metodo e’ usato per individuare cloni di DNA ricombinante

High-density filter hybridization Tutti i cloni della library di DNA vengono spottati su filtri di nylon 22 x 22 cm per scopi di ibridazione. Ogni filtro contiene 36, 864 colonie che rappresentano 18, 432 cloni indipendenti spottati in duplicato in un array 4 x 4.

Gene chips