Saggi di Mutagenicit Ames II and Ames MPF

Saggi di Mutagenicità Ames II and Ames MPF della Xenometrix

• Differenze: Ames MPF - Ames Classico • Ceppi per Ames MPF • Sostanze da testare • Procedura passo • Risultati lettura - Dati in Excel - Calcoli – Interpretazione

Ames Test • Per testare la mutagenicità di una sostanza • Menzionato nell‘OECD guideline 471 (per testare i chimici): „Bacterial reverse mutation test“ = Ames test • Il saggio di mutagenicità in vitro più usato • Molte pubblicazioni e dati

Ames Test – Principi del saggio • Ceppi batterici deficienti nella sintetizzare l’istidina (mutanti S. typhimurium) o nella sintesi del triptofano (mutanti E. coli) • Esposizione ad un agente mutageno in assenza di istidina o triptpfano • -> mutazione a wild type -> crescita -> no mutazione -> no crescita

Differenze: Ames Plate Test - Ames MPF Test (MPF = Micro-Plate Format) • Plate incorporation vs. liquid culture • Colony counting vs. colorimetry 8 measuring points per plate Controllo Negativo 1 conc. per plate Controllo Positivo

Differenze: Ames Plate Test - Ames MPF Test (MPF = Micro-Plate Format) • Incorporazione in piastre vs. cultura liquida • Conta delle colonie vs. colorimetrico 8 misurazioni per piastra 1 conc. per piastra

Saggio di Ames in Micropiastre 1 1 2 3

Mutazioni Bp – Mutazione Frameshift -Mutazioni Base-pair comportano sostituzioni -Mutazioni Frameshift comportano inserzioni o delezioni di una o più basi di DNA • Originale: ATT CAT GCG ACA TTT CTC GAT • Base Pair: THE FAT HAT ATE THE BIG RAT THE FAT CAT ATE THE BIG RAT • Frameshift –Delezione: –Inserzione: THE FAT CAA TET HEB IGR AT THE FAT CAX TAT ETH EBI GRA T

Mutazioni Bp – Mutazione Frameshift -Mutazioni Base-pair comportano sostituzioni -Mutazioni Frameshift comportano inserzioni o delezioni di una o più basi di DNA • Originale: ATT CAT GCG ACA TTT CTC GAT • Base Pair: THE FAT HAT ATE THE BIG RAT THE FAT CAT ATE THE BIG RAT • Frameshift –Delezione: –Inserzione: THE FAT CAA TET HEB IGR AT THE FAT CAX TAT ETH EBI GRA T

Ceppi usati nei test di mutagenicità batterica D. M. Maron and B. N. Ames (1983) Mutation Research 113, 173 -215 Frameshift TA 97, TA 98, TA 1537, TA 1538 Mutazione Base-pair TA 100, TA 1535 Agenti cross-linking, streptonigrina, luce UV…. TA 102, E. Coli WP 2

Ames II: ceppi S. typhimurium TA 98 his. D 3052 TAMix TA 7001 -7006 Mutazione Frameshift rfa uvr. B p. KM 101 Mutazione Base-pair rfa uvr. B p. KM 101 Ames MPF S. typhimurium strains TA 98 his. D 3052 Mutazione Frameshift rfa uvr. B p. KM 101 TA 100 his. G 46 Mutazione Base-pair rfa uvr. B p. KM 101 TA 1537 his. C 3076 Mutazione Frameshift rfa uvr. B - TA 1535 his. G 46 Mutazione Base-pair rfa uvr. B - rfa uvr. B p. KM 101 aumente la permeabilità alle sostanze chimiche deficienza nel sistema di DNA excision repair plasmide che tiene conto del sistema di riparazione del DNA-error-prone(resistenza all’ampicillina)

TA 1537 - TA 98 e TA 1535 - TA 100 TA 1537 his. C 3076 Mutazione Frameshift Acridine, proflavina, danthron daunomycin…. Ferguson & Denny 1990. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly-binding DNA ligands. Mutagenesis 5, 529 -540) TA 1535 his. G 46 Mutazione Base-pair Come TA 100 ma senza plasmide 6 -mercaptopurina e altri Prival & Zeiger 1998. Chemicals mutagenic in Salmonella typhimurium strain TA 1535 but not in TA 100. Mutat. Res. 412, 251 -260

Ames MPF : Ceppi E. coli wp 2 • mutazione A: T a livello del sito di reversione primario • Rivela: -quinoni (streptonigrina) -alcuni mutanti ossidanti (cumene hydroperoxide), -agenti cross-linking e hydrazines (Mitomycin C). E. coli wp 2 uvr. A trp. E 65 A: T Bp uvr. A deletion E. coli wp 2 [p. KM 101] trp. E 65 A: T Bp Plasmid p. KM 101

Ames MPF E. coli wp 2 Strains • mutazione A: T a livello del sito di reversione primario • Rivela: -quinoni (streptonigrina) -Alcuni mutanti ossidanti (cumene hydroperoxide), - agenti cross-linking e hydrazines (Mitomycin C). E. coli wp 2 uvr. A trp. E 65 A: T Bp uvr. A deletion E. coli wp 2 [p. KM 101] trp. E 65 A: T Bp Plasmid p. KM 101 -> E. coli trp MPF uvr. A -> E. coli trp MPF p. KM 101 -> E. coli trp MPF Combo

Ames MPF E. coli wp 2 Strains • mutazione A: T a livello del sito di reversione primario • Rivela: • quinoni (streptonigrina) • alcuni mutanti ossidanti (cumene hydroperoxide), • agenti cross-linking e hydrazines (Mitomycin C). E. coli wp 2 uvr. A trp. E 65 A: T Bp uvr. A deletion E. coli wp 2 [p. KM 101] trp. E 65 A: T Bp Plasmid p. KM 101 -> E. coli trp MPF uvr. A -> E. coli trp MPF p. KM 101 -> E. coli trp MPF Combo

E. coli wp 2 [p. KM 101], uvr. A, Combo

Fegato di ratto S 9 • Enzimi epatici per mimare il metabolismo dei mammiferi • Attivazione metabolica dei mutageni

OECD Guideline 471 per testare sostanze chimiche: Metodi: • Plate incorporation method • Preincubation method • Fluctuation method • Suspension method Almeno 5 Ceppi Batterici: • TA 98 +/- S 9 • TA 100 +/- S 9 • TA 1537 or TA 97 a +/- S 9 • TA 1535 +/- S 9 • TA 102 or E. coli wp 2…. +/- S 9

OECD Guideline 471 for Testing Chemicals: Metodi: • Plate incorporation method • Preincubation method • Fluctuation method • Suspension method Almeno 5 Ceppi Batterici: • TA 98 +/- S 9 • TA 100 +/- S 9 • TA 1537 or TA 97 a +/- S 9 • TA 1535 +/- S 9 • TA 102 or E. coli wp 2…. +/- S 9 Ames MPF Penta I Assay kit

MPF Penta I Assay • Risposte differenti alle sostanze testate • Ampio spettro di classi chimiche testate

Saggio Ames MPF Terreni Differenti Tutti i ceppi di S. typhimurium per il test di Ames dipendono dall’Istidina: • Terreno di crescita: brodo nutritivo • Terreno di esposizione: istidina limitata • Terreno indicatore: senza istidina, indicatore Tutti i ceppi di E. coli per il test di Ames dipendono dal Triptofano: • Terreno di crescita: brodo nutritivo • Terreno di esposizione: triptofano limitato • Terreno indicatore: senza triptofano, indicatore

Controlli Negativi e Positivi Controlli negativi: DMSO, Acqua per la diluizione del composto chimico e per dose zero/controllo negativo Controlli positivi: - S 9 TA 98 TA 100 TA 1535 TA 1537 E. Coli wp 2 +S 9 2 Nitrofluorene 2 -Aminoanthracene 4 NQO 2 -Aminoanthracene N 4 Aminocytidin 2 -Aminoanthracene 4 NQO 2 -Aminoanthracene

Kit Ames MPF Quando devo usare quale kit? • Ames II • Ames MPF 98/100 Screening preliminare

Ames MPF Kits When do I use which kit? • Ames II • Ames MPF 98/100 Screening preliminare • Ames MPF Penta I TA 98 TA 100 TA 1535 TA 1537 E. coli wp 2 uvr. A/p. KM 101 OECD 471

Ceppi Ames MPF - manipolazione • Liquidi: - Spediti in ghiaccio secco, conservati a – 80°C - Aggiungere direttamente al terreno di crescita • Semi-solidi: - Spediti a RT/o in ghiaccio, conservati a – 80°C - Disperdere prima di aggiungere il terreno di crescita

Domande?

Materiale richiesto e plasticheria NON incluso nel kit Nota: tutta la plastica deve essere sterile! Agitatore a 37°C, 250 rpm Incubatore a secco a 37°C Light box per lettura risultati (raccomandato) Spettrofotometro per misurazione della densità ottica a 600 nm Pipette da 20 µl, 200 µl, and 1000 µl e puntali sterili Pipette multicanale 8 -canali da 5 -50 µl e da 50 -200 µl e puntali sterilli Pipettatore multicanale 8 -canali e puntali sterili (raccomandato, ma non richiesto)

Materiale richiesto e plasticheria NON incluso nel kit P Provettoni da 50 ml con tappo (raccomando con filtro) - - piastre da 24 -pozzetti - - piastre microtiter da 384 -pozzetti - -piastre microtiter da 96 -pozzetti - -Reservoir per i reagenti - -Pipette da 5 ml e da 10 ml - -Cuvette per spettrofotometro - -Solventi per la diluizione del campione e per il controllo dose zero - -Componenti per S 9 buffer lncluso solo in alcune versioni dei kit (vedi Nota 1 all’inizio del manuale): - -Controlli positivi: 2 -nitrofluorene, 4 -nitroquinoline N-oxide, N 4 -aminocytidine e -9 -aminoacridine (per test senza S 9) o 2 -aminoanthracene (per test con S 9) - - Frazione fegato di ratto S 9

Peculiarità del protocollo di TA 100 • Sono richiesti solo 5 μl di ceppo per la coltura overnight (per gli altri si usano 10 μl). • Cultura diluita 1 : 20 nel Terreno di Esposizione (gli altri 1 : 10) • Raccommandato: passaggio di incubazione aggiuntiva di 60 -90 minuti prima del terreno di esposizione. Permette condizioni riproducibili del test con cellule nella fase logaritmica (senza cambiare il tempo totale del test di 48 ore) • Il tasso di reversione spontanea di TA 100 è abbastanza alto (cut off 12) rispetto TA 98, TA 1535 e TA 1537 (cut off 8)

Ames MPF™: Nuova manipolazione dei ceppi per ridurre il rischio di valori occasionali di baseline elevati 4°C TA 100 with solvent