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Sa 安捷伦科技 HPLC色谱柱选择与维护保养 Agilent Technologies 页

页 安捷伦HPLC色谱柱选择 Agilent Technologies

16页 300Å 孔径可改善大分子的峰形 色谱柱: 4. 6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% Me. OH: 40% 0. 1% 三氟乙酸 O 流速: 0. 75 m. L/min CH 3 CHO 温度: RT CH 2 H 3 C 检测器: UV 282 nm HC O HO O OCH 3 SB-C 3 (80Å) OCH 3 CH 2 HO 3 O O H 3 C O O 分子量虽小但 hydrodynamic volum (水动力学体积)较大的分子 N CH 3 OH HO O CH 3 OH CH 3 Tylosin(泰乐菌素) MW. 926 Pw 1/2 =0. 125 Pw 1/2 = 0. 442 0 5 Time (min) 300 SB-C 3 (300Å) 10 0 5 Time (min) • 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 • 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍 Agilent Technologies 10

19页 传统键合及封端技术 CH 3 OH OH CH 3 + Cl Si R CH 3 R = C 8, C 18, etc. 固定相键合 二甲基硅烷 O O Si R OH CH 3 O Si R CH 3 + OH Si R CH 3 Cl Si CH 3 O Si CH 3 (TMS) 封端 四甲基硅烷 Agilent Technologies O Si R

21页 液相柱---保留值与p. H的关系 色谱柱：Zorbax Stable. Bond C 18 4. 6 X 250 mm, 5 um 部件号： 880975 -906 流动相： 27%甲醇： 73%磷酸 p. H 2. 5 & 2. 6 温度： 500 C 流速： 1. 0 m. L/min. p. H变化值 0. 1 RS变化值 1. 6 Agilent Technologies

22页 液相柱---保留值与p. H的关系 色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C 8 4. 6 x 75 mm, 3. 5 µm 流动相: 44% 25 m. M磷酸, p. H 7. 00 : 56% 甲醇 流速: 1. 0 m. L/min 温度: 25°C 检测: UV 250 nm p. H 7. 00 样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. Hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. Propranolol 7. ibuprofen 0. 25 个p. H 0 1 7 6 3 1 2 1 p. H 7. 25 0 5 4 2 3 Time (min) 2 4 4 6 5 5 67 3 1 2 3 Time (min) 4 • 可电离的组份的分离可能会随p. H变化发生显著变化 —甚至很小的 0. 05– 0. 25 个p. H变化单位. Agilent Technologies 5 6

25页 液相柱---保留值与p. H的关系 Extend C 18 p. H 2~11. 5 Bonus-RP p. H 2~9 Eclipse XDB C 18 p. H 2~9 Stable. Bond C 18 p. H 1~8 Agilent Technologies

26页 复杂组分的流动相p. H选择技巧 Extend-C 18 高p. H下, p. H 7 7 4 2, Extend-C 18 p. H 11 碱性成分的保留增加 7 4 3 3 1 5 6 2 6 0 5 10 Time (min) 1. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 p. Ka 7. 6 色谱柱: ZORBAX Extend-C 18 3. Pseudo. Ephedrine 假麻黄碱 p. Ka 9. 8 4. 6 x 150 mm, 5 mm 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) p. Ka 9. 2 流动相: 30% 缓冲液: 70% 待测物p. Ka+1. 5以外 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺p. Ka 9. 1 Me. OH p. H 7 缓冲液 20 m. M 的流动相p. H Na 2 HPO 4 p. H 11缓冲液 20 m. M 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶p. Ka 6. 5 可保证方法的稳定性 TEA 7. Diphenhydramine 苯海拉明 p. Ka 9. 0 0 5 Time (min) 流速: 1. 0 m. L/min 温度: RT 检测器: UV 254 nm Agilent Technologies

29页 Zorbax 产品系列 反相色谱柱 低p. H 中p. H Stable. Bond Eclipse XDB Extend 空间位阻保护 双封端 双齿键合+双封端 SB-C 18 80 A & 300 A p. H: 1~8 SB-C 8 80 A & 300 A p. H: 1~8 SB-苯基 80 A p. H: 1~8 高p. H SB-CN 80 A & 300 A p. H: 1~8 SB-C 3 80 A & 300 A p. H: 1~8 Eclipse XDB-C 18 Extend-C 18 80 A & 300 A p. H: 2~9 p. H: 2~11. 5 Eclipse XDB-C 8 80 A p. H: 2~9 空间位阻保护 + 三封端 80 A p. H: 2~9 可使用 100%水相 SB-AQ 空间位阻保护 80 A Poroshell 300 SB-C 18 Eclipse XDB-苯基 80 A 实心核多孔壳 p. H: 1~8 Bonus-RP p. H: 2~9 Agilent Technologies p. H: 1~8

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31页 Zorbax色谱柱=高柱效 +长寿命 Norm. 50 40 1 30 20 10 0 0 柱效 进样次数 #3 #4 1 6635 6138 100 6857 6372 6882 2 200 6381 300 6895 6381 400 6883 6294 500 6815 6312 600 6687 3 6236 700 6653 6115 800 6695 6221 900 6781 6300 1050 6810 6302 10511300 6858 6528 10522034 6823 6343 0. 5 1 色谱柱: 流动相: 流速: 温度: 检测: 1. 2. 3. 4. ZORBAX SB-C 18 4. 6 x 30 mm, 1. 8 um 60% 甲醇: 40 水 1 m. L/min 室温 UV 254 nm 样品 尿嘧啶 苯酚 4 -Cl-硝基 苯 甲苯 1. 5 Agilent Technologies 4 2 min

35页 HPLC常用的色谱柱接头 Swagelok 安捷伦 1100液相 0. 09 in. = 2. 33 mm Waters Parker 0. 13 in. = 3. 37 mm 0. 09 in. = 2. 33 mm Rheodyne Valco 0. 17 in. = 4. 40 mm 0. 08 in. = 2. 07 mm Uptigh t 0. 09 in. = 2. 33 mm Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W. Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6: 788 (1988) Agilent Technologies

38页 活塞杆与密封圈 2 2 塔板数 USP拖尾因子 (5%) 1. 2235 2. 3491 3. 5432 1. 72 1. 48 1. 15 0. 0 塔板数 USP拖尾因子 (5%) 3 3 1 0. 5 1. 3670 2. 10457 3. 10085 1 1. 0 Time (min) 1. 5 0. 0 更换前 色谱柱: Bonus - RP 4. 6 x 75 mm, 3. 5 mm 流动相: 30% H 2 O : 70% Me. OH 流速: 1. 0 m. L/min 温度：室温 检测器: UV 254 nm 0. 5 1. 0 Time (min) 1. 5 2. 0 更换后 样品: 1. 尿嘧啶 2. 苯酚 3. N, N-二甲基苯胺 Agilent Technologies 1. 45 1. 09 1. 00

39页 检测器用灯 Agilent Technologies

40页 检测器用灯 Agilent Technologies

41页 检测器用灯 Agilent Technologies

46页 中性分析时为何要使用缓冲液？ 色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C 8, 4. 6 x 75 mm, 3. 5 µm 流动相: 44% A : 56% 甲醇 流速: 1. 0 m. L/min 温度: 25°C 检测: UV 250 nm 样品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranolol 7. ibup A = p. H 7. 0水 A = p. H 7. 0 1, 4, 6, 7 水+25 m. M 磷酸缓冲液 1 4 5 2 7 2 5 3 6 3 0 1 2 3 Time (min) 4 • 含缓冲液的流动相可改善保留, 分离和色谱峰峰形. Agilent Technologies 5

47页 增加缓冲液浓度减少拖尾 10 m. M 磷酸盐 p. H 7. 0 1 2 3 4 5 USP Tf 1. 1. 62 2. 1. 65 3. 1. 63 4. 1. 77 5. 1. 83 6. 1. 12 25 m. M 磷酸盐 p. H 7. 0 USP Tf 色谱柱: C 8 1. 1. 41 2. 1. 50 3. 1. 33 4. 1. 39 5. 1. 36 6. 1. 00 流动相: 1 2 3 4 流速: 温度: 5 6 6 0 2. 5 5. 0 Time (min) 7. 5 0 2. 5 ZORBAX Eclipse XDB 4. 6 x 150 mm, 5 mm 40% 磷酸盐缓冲液 60% ACN 1. 5 m. L/min. 40°C 样品: Tricyclic Antidepressants （三环抗抑郁剂） 1. Desipramine（脱甲丙咪嗪 2. Nortriptyline（去甲替林） 3. Doxepin（多塞平） 4. Imipramine（丙咪嗪） 5. Amitriptyline（阿米替林） 6. Tr. Imipramine（三甲丙咪嗪 5. 0 Time (min) • 在中等p. H下, 离子强度较高, 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾 Agilent Technologies

48页 TEA对碱性成分峰形的影响 色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C 8, 4. 6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 85% 25 m. M Na 2 HPO 4 : 15% ACN 流速: 1. 0 m. L/min. 温度: 35°C p. H 7 1 10 m. M TEA 1 No TEA USP TF 5% 1. 1. 29 2. 1. 33 3. 1. 63 4. 2. 35 5. 1. 57 0. 0 样品: 2 3 2. 5 Time (min) 4 5 5. 0 1. Phenylpropanolamine （去甲麻黄碱） 2. Ephedrine（麻黄素） 3. Amphetamine（苯丙胺） 4. Meth. Amphetamine（脱氧麻黄碱） 5. Phenteramine （苯丁胺） 0 4 2. 5 Time (min) Agilent Technologies 5 USP TF 5% 1. 1. 19 2. 1. 18 3. 1. 20 4. 1. 26 5. 1. 14 5. 0

53页 目录P 625 环保 除草剂: 柱温的影响 Herbicides: Effect of Column Temperature 液相色谱柱: Zorbax Stable. Bond-C 18 色谱柱尺寸: 4. 6 x 150 mm, 5μm 部件号: 883975 -902 40℃ 样品: 流动相: 流速: 温度: 检测: 除草剂 52/48 0. 1 M乙酸钠/甲醇, p. H 6 0. 45 m. L/min 40℃, 90℃ UV 1. 西玛津 2. 敌草隆 3. 扑灭津 4. 扑灭净 5. 异丙甲草胺 90℃ 1. Simazine 2. Diuron 3. Propazine 4. Prometryn 5. Metolac hlor 提高柱温，可增加柱 效（提高灵敏度） Agilent Technologies

54页 目录P 611 生物制药 肽类/蛋白质: 升温对分离的影响 Peptides/Proteins: Effect of Elevated Temperature 样品: 流动相: 液相色谱柱: Zorbax 300 Stable. Bond-C 3 色谱柱尺寸: 4. 6 x 150 mm, 5μm 部件号: 883995 -909 梯度: 多肽 A = 5: 95, 乙腈 : 水, 0. 10%三氟乙酸 (V/V%) B = 95: 5, 乙腈 : 水, 0. 085%三氟乙酸 (V/V%) 在 20 min内 15 -53%, 后运行时间 12 min 流速: 温度: 检测: l. 0 m. L/min 室温 -60℃ UV 215 nm 1. 亮氨酸脑啡呔 1. Leucine 2. 血管紧张素II Enkephalin 3. 核糖核酸酶A 2. Angiotensin II 4. 牛胰岛素 3. Rnase A 5. 细胞色素C 4. Insulin(BOV) 6. 溶菌酶 5. Cytochrome C 7. 肌红蛋白 6. Lysozyme 8. 碳酸酐酶 7. Myoglobin 8. Carbonic anhydrase 提高柱温， 可增加柱效 （提高灵敏度） Agilent Technologies

55页 目录P 611 生物制药 减小毛细管内径来提高 低浓度样品的检测灵敏度 流动相: Reducing Capillary ID to Improve Sensitivity 流速: for Concentration-Limited Samples 温度: 检测器: 样品: 液相色谱柱: Zorbax Stable. Bond-C 8 色谱柱尺寸: 150 mm, 5μm 60%乙腈/40%水 内径 0. 3 mm-4 u. L/min 内径 0. 5 mm-10 u. L/min 内径 1. 0 mm-50 u. L/min 内径 4. 6 mm-1. 0 u. L/min 室温 UV 254 nm 200 ng联二苯 (100 nl) 减小柱径，可增 加柱效（提高灵 敏度） Agilent Technologies

57页 色谱柱技术 – 5988 -6428 EN 不同硅胶类型比较 (TE 1) 液相色谱柱 Zorbax Sil Spherisorb 1. 2. 3. 4. 甲苯 N-苯甲酰苯胺 苯酚 苯甲醇 1. 2. 3. 4. toluene benzanilide phenol benzyl alcohol 流动相: 含 0. 05%甲醇的二氯甲烷 Zorbax Rx-Sil 使用高纯硅胶， 可增加柱效 （提高灵敏度） Agilent Technologies

58页 液相色谱柱: ZORBAX Stable. Bond-C 18 色谱柱尺寸: 4. 6 x 150 mm 5µm 部件号: 883975 -902 有机化学– 5988 -6366 EN p. H对苯胺取代物分析的影响 (ORCH 1) p. H: 2. 5 1. 2. 3. 4. 5. 6. 对位甲氧基苯胺 间位苯甲胺 3 -氨基-苯甲腈 对位氯苯胺 间位氯苯胺 邻位氯苯胺 1. 2. 3. 4. 5. 6. p-anisidine m-toluidine 3 -amino-benzonitrile p-chloroaniline m-chloroaniline o-chloroaniline 流动相 25 m. M磷酸: 甲醇=58: 42 流速: 1 m. L/min 22°C p. H: 7. 0 改变流动相p. H， 可增加柱效 （提高灵敏度） Agilent Technologies

62页 色谱柱技术 – 5988 -6453 EN ZORBAX Eclipse系列色谱柱 的选择性 (TE 31) 液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl 色谱柱尺寸: 4. 6 x 150 mm 5µm 部件号: 993967 -912 Zorbax Eclipse XDB-苯基 1. 2. 3. 4. 5. 尿嘧啶 苯酚 4 -氯-硝基苯 甲苯 萘 1. 2. 3. 4. 5. Uracil Phenol 4 -Cl-nitrobenzene Toluene Naphthalene 流动相: 甲醇 : 水=70: 30 UV: 254 nm 流速: 1. 0 m. L / min. 室温 Zorbax Eclipse XDB-C 8 Zorbax Eclipse XDB-C 18 改变键合相， 可增加柱效 （提高灵敏度） Agilent Technologies

63页 目录P 613 生物制药 三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类 RP-HPLCESI-MS分离的选择性比较 Selectivity Comparison of TFA and NH 4 OH for Peptide RP-HPLCESI-MS Analysis 流速: 温度: 梯度: LC/MS: 样品: 0. 25 m. L/min. 25℃ 5 -60% B in 20 min. 正离子, ESI- Vf 70 V, Vcap 4. 5 k. V, N 2 - 35 psi, 12 L/min. , 300℃ 4μL (各50 ng) 液相色谱柱: Zorbax Extend-C 18 色谱柱尺寸: 2. 1 x 150 mm, 5 um 部件号: 773700 -902 三氟乙酸条件: A- 0. 1%三氟乙酸水溶液 B-0. 085%三氟乙酸 80%的乙腈溶液 改变有机添加剂， 可增加柱效 （提高灵敏度） NH 4 OH条件: A- 20 m. M NH 4 OH水溶液 B- 20 m. M NH 4 OH 80%的乙腈溶液 Agilent Technologies

页 附录-1 倍数 1, 000, 000 = 1018 1, 000, 000 = 1015 1, 000, 000 = 1012 1, 000, 000 = 109 1, 000 = 106 1, 000 = 103 100 = 102 10 = 101 0. 1 = 10 -1 0. 01 = 10 -2 0. 001 = 10 -3 0. 000 001 = 10 -6 0. 000 001 = 10 -9 0. 000 000 001 = 10 -12 0. 000 000 001 = 10 -15 0. 000 000 000 001 = 10 -18 前缀 petagigakilohectodecicentimillinanofemto- 符号 exa. P tera. G mega. K H dekad c m micron picof atto- E T M mg/m. L = 1, 000 ppm da u p a ppm ( part per million) = mg/kg, ug/g, ng/mg, pg/ug, mg/L, ug/m. L, ng/u. L ppb ( part per billion) = ug/kg, ng/g, pg/mg, ug/L, ng/m. L, pg/u. L ppt ( part per trillion) = ng/kg, pg/g, fg/mg, ng/L, pg/m. L, fg/u. L Agilent Technologies