Rozptyl zen na atomu Interference rozptlench vln Atomov

Rozptyl záření na atomu Interference rozptýlených vln: Atomový rozptylový faktor: Atomový rozptylový faktor je definován jako poměr amplitudy záření rozptýleného atomem k amplitudě záření rozptýleného za stejných podmínek elektronem. 1

Atomový rozptylový faktor § § § Atomový rozptylový faktor je Fourierovou transformací elektronové hustoty atomu Vysoce lokalizované elektrony (např. 1 s) mají vysoký atomový rozptylový faktor v širokém oboru q-vektoru Atomový rozptylový faktor špatně lokalizovaných elektronů rychle ubývá s rostoucím q (s klesající vlnovou délkou l) 2

3

Strukturní faktor Experimentální veličiny Elektronová hustota r Fázový problém

Monokrystalová strukturní analýza • Příprava krystalů vhodných k difrakčnímu měření • Sběr difrakčních dat • Řešení fázového problému • Upřesnění struktury Malé vzorky (~ 0. 1 mm), nejlépe kulový tvar Biologické vzorky - v mateřském roztoku, molekuly solvátu (30 -70 %) Mezní rozlišení atomů - Rmin = 0. 92 dmin qmax= 25° pro Mo Ka Omezení pro makromolekuly

Určení symetrie krystalové struktury Bijvoetovy páry Centrosymetrický krystal Necentrosymetrický krystal Friedelův zákon Intenzita závisí pouze na velikosti strukturních faktorů Difrakční obraz je vždy centrosymetrický Vážená reciproká mříž každého krystalu je centrosymetrická

Intenzita difraktovaných svazků závisí pouze na velikosti strukturních faktorů a nezávisí na jejich fázi Anomální disperze Centrosymetrický krystal Necentrosymetrický krystal

Laueova grupa symetrie 10 možných typů lauegramů Lze určit pouze makroskopické prvky symetrie

Vyhasínání reflexí Subtranslace šroubové osy skluzové roviny Př. 21 podél c Pro 00 l (x, y, z) centrování mříže Součet přes páry atomů symetricky sdružených operací 21 Pro l liché, F 00 l = 0 Šroubové osy se projevují vyhasínáním – h 00, 0 k 0, 00 l, hh 0 Skluzové roviny se projevují vyhasínáním – 0 kl, h 0 l, hhl, hk 0

Vyhasínání vlivem centrování buňky Možné difrakce Typ mříže h + k + l = 2 n I h + k = 2 n C h + l = 2 n B l + k = 2 n A h + k = 2 n h + l = 2 n l + k = 2 n F -h + k + l = 3 n R Určení typu mříže a přítomnost šroubových os nebo skluzových rovin Obecné a speciální vyhasínací podmínky

Renningerův jev – vícenásobná difrakce Komplikace při hledání prvků symetrïe Určení Laueho grupy symetrie Typu mříže Přítomnosti šroubových os a skluzových rovin z vyhasínání Difrakční symboly 122 symbolů mmm. I--mmm. I-ammm. Ibca

Daný atom nepřispívá k pozorované intenzitě

Rozdělení elektronové hustoty Fourierova řada periodicita

Fourierova syntéza, mapy elektronové hustoty Dvojrozměrné řezy Projekce Translační perioda Projekce vážené reciproké mříže do roviny l = 0

Metody řešení struktur Iterativní metody - struktury určené symetrií krystalu jednoparametrové struktury Př. Cs. Cl, Na. Cl, KCl, U [Valvoda, str. 292] Cs. Cl Jedna vzorcová jednotka na buňku Primitivní buňka Difrakční symbol m-3 P--- nebo m-3 m. P--P 23, Pm-3, P 432, P-43 m, Pm-3 m Ekvivalentní polohy 1 a: 0 0 0, 1 b: ½ ½ ½ Pattersonovské metody Přímé metody

Pattersonovské metody Pattersonova funkce Maxima odpovídají všem možným meziatomovým vektorům spojujícím atomy v elementární buňce. Tato maxima mají stejnou periodicitu a symetrii jako krystalová mřížka. Výška píku je úměrná součinu protonových čísel atomů spojených vektorem u vynásobeném multiplicitou tohoto vektoru (N 2 maxim)

Výrazná maxima v Pattersonově funkci 1. Řada vektorů se stejnou délkou a směrem 2. Limitovaný počet těžkých atomů s protonovým číslem výrazně větším než zbývající atomy těžký atom – výrazné maximum na mapě těžký atom – lehký atom – střední maximum na mapě lehký atom – velmi malé maximum na mapě Vždy centrosymetrická funkce zachovává centraci prvky symetrie s translační složkou jsou nahrazeny prvky bez této složky Použití projekcí Pattersonovy funkce

Pětiatomová molekula Všechny možné meziatomové vektory Maxima elektronové hustoty rozšíření Pattersonova mapa Zaostřené Pattersonovy funkce Pattersonova funkce

V Pattersonově mapě můžeme každý atom posunout do počátku Intenzita píku v počátku je úměrná SZ 2 Intenzita dalších píků je úměrná součinu Z atomů * vzdálenost

Přítomnost píků v určitých polohách dává informaci o prvcích symetrie přítomných v jednotkové buňce a o souřadnicích atomů, které jsou spojeny těmito prvky. Ty speciální polohy jsou známé jako Harkerovy linie and Harkerovy roviny (nebo řezy).

Příklad Molekula s jedním atomem Br krystalující v P 212121. Pattersonovy píky (“+” může být nahrazeno “±” signs).

Nejintenzivnější píky v mapě Br-Br. V Harkerově sekci (1/2, v, w) pro 21 podél směru a, vidíme pík (48/96, 11/100, 21/100). Z předchozí tabulky – pík odpovídá reálným souřadnicím (1/2, 1/2 -2 y, 2 z), tedy: y = (0. 11 -0. 5)/(-2) = 0. 195 z = 0. 21/2 = 0. 105 Tak lze určit dvě souřadnice, třetí z dalších Harkerových řezů.

V Harkerově sekci (u, 1/2, w) pro 21 podél b vidíme pík (34/96, 50/100, 29/100). Z tabulky – reálné souřadnice (2 x, 1/2 -2 z), tedy: x = 17/96 = 0. 177 a také 0. 5 - 2(0. 105) = 0. 29 ? 0. 5 – 0. 21 = 0. 29, pro potvrzení Souřadnice atomu Br v mříži tedy jsou: (0. 177, 0. 195, 0. 105) Další mohou být generovány vztahy pro ekvivalentní polohy

Kontrola: V Harkerově řezu (u, v, 1/2) 21 podél c, vidíme pík (14/96, 39/100, 50/100). Reálné souřadnice (1/2 -2 x, 2 y, 1/2), tedy x = (0. 146 -0. 5)/(-2) = 0. 177 y = 0. 39/2 = 0. 195 Existují další řešení pro různé kombinace “+” a “-”. Symetricky vztažené nebo s posunutým počátkem.

Pattersonovy metody 1. Výpočet Pattersonovy funkce: P(uvw) 2. Hledání možných poloh těžkých atomů 3. Z těchto poloh a elektronové hustoty výpočet přibližného fázového úhlu (ahkl) pro každou relfexi 4. Z těchto aproximativních ahkl výpočet r(xyz) 5. Rozumná interpretace map elektronové hustoty

Metoda těžkého atomu Polohy těžkých atomů známé (např. z Pattersonovy funkce) n těžkých atomů Postupná Fourierova syntéza se startovacím souborem FH o stejných znaménkách jako FHT. Rozptyl na těžkých atomech dominuje a určuje znaménka většiny strukturních faktorů

Příklad -25/60 m 1/m 2 = 3/8 -17/60 -12/60 -4/60 12/60 17/60 25/60 f 1 ~ 3·(-2 sin 2 q/l 2) h F(h) FT(h) 0 34 16 1 4 5 2 -11 -10 3 -7 -13 4 5 3 5 11 14 6 -6 6 7 -6 -9 8 -16 -11 9 -4 1 f 2 ~ 8·(-2 sin 2 q/l 2)

Pattersonova funkce x. T = 0, 196 ~ 12/60 Fourierova syntéza se znaménky určenými z poloh těžkých atomů a vynecháním nejistě určených faktorů Fourierova syntéza se správnými znaménky Fourierova syntéza s váženými koeficienty

Přímé metody Statistické metody, využití obecných informací o elektronové hustotě, nerovností Cauchy Střed symetrie Jednotkové strukturní faktory

Elektronová hustota musí být nezáporná a soustředěná do konečného počtu diskrétních atomů Karle, Hauptman

Pro střed symetrie UH = -UH Neznámá pouze fáze U 2 H známé Dvojčetná osa ve směru c Rovina zrcadlení kolmá k ose c Pro velké U 2 H a UH lze volit pouze +

Centrální limitní teorém N nezávislých náhodných proměnných xj se střední hodnotou < xj > a rozptylem Střední hodnota součtu Normální rozdělení

Centrosymetrický krystal Součet N/2 nezávislých náhodných veličin se střední hodnotou Náhodné rozdělení souřadnic Rozptyl Distribuční funkce F Se stejnou pravděpodobností kladná nebo záporná

Necentrosymetrický krystal Celková pravděpodobnost, že A leží mezi A a A+d. A a B mezi B a B+d. B je P(A). P(B)

Normalizované strukturní faktory Počet identických příspěvků k FH od symetricky ekvivalentních atomů N. . . Počet atomů v základní buňce Atomové číslo Rozptyl na bodovém nekmitajícím atomu, úhlově nezávislý Mapa s ostrými maximy centrosymetrické necentrosymetrické

Strukturní invarianty Fáze obecně závisí na volbě počátku buňky Součet fází fh 1¡+ fh 2+ fh 3 je strukturní invariant (nezávislý na volbě počátku mříže), pokud h 1 + h 2 + h 3 = 0 (součet tří difrakčních vektorů je nulový) obecně H 1 + H 2 + … + Hn = 0 Strukturní invarianty Triplety, kvartety, F 000 H = K + (H - K)

Elektronové hustoty jsou nezáporné Pro podobné sin q/l >0 >0 >0 Pro velká |F| >0 Pro velké strukturní amplitudy Součet kladných a záporných hodnot malé číslo

Centrosymetrické krystaly Sayreho rovnice Pro silné reflexe k a h - k, určuje součin těchto reflexí v Sayreho vztahu znaménko Pravděpodobnost, že je vztah pravdivý Čím větší jsou hodnoty Eh, Ek, Eh-k, tím větší je pravděpodobnost správného určení znaménka

Necentrosymetrické krystaly Pro N identických atomů náhodně rozložených v buňce Von Misesovo rozložení Koncentrační parametr L normalizační parametr závislý na GHK Pro neidentické atomy

Necentrosymetrické krystaly Nejpravděpodobnější hodnota strukturního invariantu je rovna nule Tangentová formule Střední hodnota pro různá K Nejpravděpodobnější hodnota H S variancí správné hodnoty fáze H

Příklad 1 D molekuly Pomocí přímých metod odhadujeme fáze nejsilnějších reflexí a poté použijeme fázové relace pro generování elektronové hustoty, přičemž vyloučíme záporné hustoty. Následně zkoumáme chemický smysl mapy Nízkoúhlové reflexe poskytují hrubý odhad a vysokoúhlové jemné detaily. V tomto případě se získá nejlepší řešení pro záporné fáze reflexí (004), (005). Strukturní faktory (00 l)

Jelikož 4+5 = 9, znaménko (009) bude kladné, protože: ( -)(-) = (+). Pomocí podobných fázových relací pro další relativně silné reflexe |F(00 l)| získáme rozumnou mapu elektronové hustoty Vysoké píky pro atomy Br a nízké pro řadu atomů C v molekule.

Přímé metody 1. Identifikace silných linií 2. Nalezení strukturních invariantů 3. Odhad fází a určení fázových vztahů 4. Použití odhadů k výpočtu přibližného fázového úhlu(ahkl) pro každou reflexi 5. Použití hodnot ahkl k výpočtu r(xyz) a jejímu znázornění 6. Interpretace mapy elektronové hustoty a chemicky rozumná interpretace

Substituční metody MIR - Multiple Isomorphous Replacement SIR- Single Isomorphous Replacement SIRAS - Single Isomorphous Replacement and Anomalous Scattering Příprava derivátů. Nahrazení několika atomů ve známých polohách jinými atomy (např. lehkých atomů těžkými) Hlavní užití – při studiu makromolekul

Určení poloh těžkých atomů Těžký atom Proteinový derivát Diferenční Pattersonovy mapy Izomorfní diferenční Pattersonova mapa (hypotetická struktura jen z těžkých atomů) Pro centrické reflexe (fáze nabývají pouze dvou hodnot) FPD, FP rovnoběžné většinou Protein Grafické schema metody SIR dvě řešení Pro centrické reflexe Jinak nejednoznačnost

MIR Experimentální chyby (intenzity, polohy obsazovací faktory, teplotní faktory) Ztráta izomorfie Řešení dvou rovnic Pravděpodobnostní rozdělení φP Nejpravděpodobnější Fourierova mapa Figure of merit Nejlepší F. mapa

Příklad pro centrosymetrický krystal: Izomorfní deriváty A, B Faktory symetrie známé Př. Jediné vhodné řešení Následná Fourierova syntéza

Metoda anomální disperze MAD - Multi-wavelength Anomalous Diffraction Centrosymetrický krystal změřené hodnoty FH je pro centrosymetrický krystal reálná veličina l v blízkosti absorpční hrany těžkého atomu

Anomální část od anomálně rozptylujících atomů (a) Neanomální část od anomálně rozptylujících atomů Od neanomálně rozptylujících atomů Separace členů závislých na vlnové délce Měřící body + pro F+ Určení f z experimentálně měřené fluorescence

Molekulární přemístění (molecular replacement) Umístění molekuly nebo fragmentu znamé struktury do mřížky. Určení rotační a translační části molekuly převádějící jí ze známého systému do určovaného. známá neznámá Patersonova funkce molekuly otočené o C Patersonova funkce krystalu Hledání maxim rotační funkce Hledání maxim translační funkce (překryv maxim extramolekulárních píků) Mezimolekulové píky sousedních atomů

Postup při určování struktury Sběr dat Orientační matice O Vztah mezi souřadným systémem krystalu (C) (goniometrické hlavičky) a systémem reciproké mříže* Souřadnice vektoru h popisujícího nějakou veličinu v reciprokém prostoru systém krystalu laboratorní systém reciproký systém Pro určení orientační matice stačí znalost přesných hodnot Millerových indexů a reciprokých souřadnic pro tři nekoplanární difrakční vektory

„Peak hunting“ – orientační reflexe, ve středu Braggových úhlů Indexace píků Volba vhodné počáteční reciproké buňky Tři nejkratší nezávislé vektory vybrané z tabulky difrakčních vektorů a rozdílů difrakčních vektorů, pomocí nichž se podaří přiřadit Millerovy indexy všem vstupním orientačním reflexím Indexace v přímém prostoru Koncové body libovolných nezávislých uzlových vektorů v reciprokém prostoru definují rovinu, jejíž normála splývá s nějakým vektorem v přímém prostoru Projekce všech uzlových bodů reciprokého prostoru do směru vektoru odpovídajícího přímého prostoru tvoří jednodimenzionální mřížku. Upřesňování orientační matice minimalizace Počet orientačních reflexí

Měření integrálních intenzit w sken w-2 q sken

Rotační metoda Vhodná pro velké buňky (velké množství reflexí) Krystal rotuje nebo osciluje kolem osy kolmé na dopadající paprsek Difrakční podmínka je splněna pro úseky rovin v reciprokém prostoru, které mají nenulový průnik s lunetami vymezenými Ewaldovými koulemi odpovídajícími krajním polohám. Reflexe obsažené v každém z párů lunet mají společný jeden z indexů Zakázaná oblast Nutnost více os

Monokrystalový difraktometr s plošným detektorem Rmax = l/2 sin qmax Rmin = l/2 sin qmin 2 qmax = qc + tan-1(a/2 D) 2 qmin = qc - tan-1(a/2 D) Různé oscilační intervaly

Korekce na Lorentzův faktor a polarizaci Korekce na absorpci Transmisní koeficient T Analytické korekce: Koule, válec, čtyřstěn Mnohostěn lze rozdělit na sumu čtyřstěnů Empirické korekce Dráhy dopadajícího a difraktovaného svazku Hmotový absorpční koeficient Hmotnostní frakce

Postup při určování struktury Měřené intenzity korigované na Lp faktor, případně absorpční faktor, určení škály Statistická analýza v souboru reflexí Hodnoty atomových faktorů pro s = <s 2>-(1/2) Hodnoty strukturních faktorů přibližně korigované na vliv teplotních kmitů Výpočet normalizovaných strukturních faktorů

Iterativní určování fází Roztřídění reflexí do skupin podle kombinací sudých a lichých indexů Setřídění podle hodnot normalizovaných strukturních faktorů Výběr tří vhodných skupin a v nich max. |Eh| Přiřazení fází těmto hodnotám Výběr dalších reflexí s velkými |Eh| a přiřazení symbolických fází Startovací soubor reflexí Fourierova syntéza s koeficienty Eh

Opakovaná Fourierova syntéza Neznámé souřadnice Potřebujeme Známé souřadnice Nejlepší odhad nahrazením exp( ) střední hodnotou <cos a> Besselovy funkce Fourierova transformace s koeficienty Pro centrosymetrické krystaly Sumace přes Q neznámých atomů

Schema určování fází přímými metodami Normalizace |Fobs| Nalezení strukturních invariantů Volba optimální počáteční množiny fází Výpočet fází strukturních faktorů Eobs Test fází Výpočet Fourierovy mapy Interpretace Fourierovy mapy

Upřesňování struktury V přímém nebo v reciprokém prostoru Modelová struktura Upřesněná struktura

Elektronová hustota azidopurinu a) b) c) d) Rozlišení 0, 55 nm – 7 reflexí 0, 25 nm – 27 reflexí 0, 15 nm - 71 reflexí 0, 08 nm – 264 reflexí

Rozdílová Fourierova syntéza Elektronová hustota spočtená bez neznámých poloh

Upřesňování v reciprokém prostoru monokrystal polykrystal Porovnávání spočtených a naměřených strukturních faktorů Metoda nejmenších čtverců Simulované žíhání Genetický algoritmus Faktor spolehlivosti

Metoda nejmenších čtverců Constrained (rigid body) Restrained další informace o struktuře a vazbách Škálovací faktor Přes vazby Z databází Stejná vazba zpřesňovaná

Simulované žíhání Startovní model Snížit teplotu a „zamíchat“ s atomovými souřadnicemi Ne Ano Struktura vyřešena Globální minimum? Nalezení minima kriteriální funkce

Simulované žíhání Pravděpodobnost nalezení systému ve stavu Energie systému parametry teplota Molekulární dynamika Řešení soustavy Zabudování teploty Škálováním rychlostí Výchozí teplota Langevinova mechanika Náhodná síla Berendsenova mechanika tlumení

Škálovací konstanta potenciální energie Simulované žíhání prvního druhu EPOT = Echem + w. Eexp Nulový bod rotace 1. člen. . . Vibrace zvětšující a zmenšující vazební vzdálenost 2. člen. . . Vibrace měnící vazebné úhly 3. člen. . . Nevazební energie spojená s van der waalsovskou a coulombovskou interakcí vazbou nespojených atomů odp. min. energii Parametry z QM výpočtů, vibračních spekter 4. člen. . . Energie spojená s torzními úhly Simulované žíhání druhého druhu Konstantní T, mění se W

Direct Space Methods Rafinovatelné parametry leží v přímém prostoru Difrakční informace je doplněna chemickou znalostí (konektivita, vazebné délky, úhly, torzní úhly) 1. Konstrukce zkušební struktury nahodilým umístěním atomů s uvážením molekulárních fragmentů či celých molekul (známých či odhadnutých) a informace o prostorové grupě. 2. Po spočtení difrakčních dat a srovnání s měřenými daty, úprava variabilních parametrů pro optimalizaci shody (minimalizaci vhodné funkce)

Simulované žíhání Startovní model Snížit teplotu a „zamíchat“ s atomovými souřadnicemi Ne Ano Struktura vyřešena Globální minimum? Nalezení minima kriteriální funkce