RNA i transkrypcja u eukariontw Rodzaje sekwencji w

RNA i transkrypcja u eukariontów

Rodzaje sekwencji w DNA (sekwencje kodujące w genomie człowieka – 0, 015% (+niekodujące sekwencje regulatorowe – promotory/enhancery/izolatory) Single copy genes Kodujące

Rozmieszczenie sekwencji w chromosomach Konstytutywna heterochromatyna

Rozproszone rodziny genowe Ludzkie geny globinowe typu α i β Ψ - pseudogeny ξ, ε, γ -globiny płodowe

Zwarte rodziny genowe Geny kodujące histony w genomie Drosophila a, b, c, d, e – krótkie sekwencje rozdzielajace poszczególne geny

Geny nieciągłe Początek pierwszego eksonu (5’ koniec m. RNA) Kraniec ostatniego eksonu (3’ koniec m. RNA) Zawartość genów nieciągłych: Drożdże – 5% (ale 26% wszystkich transkryptów) Rośliny i zwierzęta – większość genów ( ≥ 85%) Gen Dystrofiny (dystrofia mięśniowa Duchenne’a) – 75 intronów 2, 5 mln pz. ; Eksony – 11 000 pz. (0, 5% genu) Długość intronów: 31 pz (SV-40) – 210 000 pz (Dystrofina) Sens biologiczny intronów? 60% genów ludzkich – alternatywny splicing

Transkrypcja w komórce eukariotycznej Transkrypt – kopia nici matrycowej DNA o sekwencji Identycznej z sekwencją nici kodującej DNA Trzy fazy transkrypcji: inicjacja, elongacja, terminacja Podstawowe elementy systemu transkrypcji: polimerazy RNA czynniki transkrypcyjne sekwencje regulatorowe w DNA

Bakteryjna polimeraza RNA • Białko o masie ok. 480 kd • Cztery podjednostki: alfa (α), beta (β), beta’ (β‘) i sigma (δ); tylko pierwsze trzy niezbędne do aktywności enzymatycznej (rdzeń polimerazy) • Czynnik sigma niezbędny dla wiązania RNA polimerazy do promotora; enzym ma ogólne powinowactwo do DNA, w obecności czynnika sigma wiąże się jednak wyłącznie do promotora.

Eukariotyczna Polimeraza RNA • Cztery typy • Mitochondrialna – 1 (u roślin także – chloroplastowa) • Jądrowe: - 3 • Typ • RNA Polymerase I • • RNA Polymerase II • • Masa Pol II ponad 500 kd Dwie duże podjednostki; ok. 10 małych podjednostek; największa podjednostka: homologiczna do β', następna co do wielkości – do β. Dla wiązania się z DNA potrzeba wielu czynników nie należących do kompleksu polimerazy • Produkt Lokalizacja r. RNA jąderko Budowa Podjedn. α-amanityna Niewrażliwa hn. RNA nukleoplazma Podjedn. B. wrażliwa sn. RNA (splicing) RNA Polymerase III t. RNA nukleoplazma Podjedn. Umiark. wrażliwa 5 S r. RNA

Polimerazy RNA Prokarionty Eukarionty Homologi Homlogi

Transkrypcja u bakterii - inicjacja

Transkrypcja u bakterii - elongacja

Promotor u prokariontów

Sekwencje regulatorowe Pol II Eukarionty

Sekwencje regulatorowe Pol I i Pol III -107 do -180 -45 do +20 Pol I – promotor dwuskładnikowy Pol III – dwa typy promotorów Zewnętrzny (zawiera TATA) sn. RNA Wewnętrzny +55 do +80 5 s r. RNA

Składniki kompleksu transkrypcyjnego • A) Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF) – takie same dla wszystkich genów transkrybowanych przez daną polimerazę RNA - wraz z polimerazą stanowią tzw. „Podstawowy Aparat Transkrypcyjny”, wiążą się do sekwencji w obrębie bliskiego promotora i miejsca startu transkrypcji. • B) Aktywatory – Czynniki Transkrypcyjne (TF) oddziałujące bezpośrednio z DNA, wiążą się do sekwencji dalszego promotora i sekwencji w enhancerach. • C) Koaktywatory i Korepresory – białka nie oddziałujące bezpośrednio z DNA, stanowią ogniwo pośrednie umożliwiające oddziaływania między TF związanymi z dalszym promotorem i enhancerami a Podstawowym Aparatem Transkrypcyjnym. •

Porównanie inicjacji transkrypcji u pro- i eukariontów

Sekwencje w promotorze Pol II

Czynnik transkrypcyjny AP 1 ma domenę z motywem suwaka leucynowego

Suwak leucynowy

Czynnik transkrypcyjny Sp 1 ma domenę z motywem palców cynkowych

Motyw palców cynkowych

Czynniki transkrypcyjne z motywem H-T-H (Helix-Turn-Helix)

Oddziaływanie z DNA warunkuje interakcje

Inicjacja transkrypcji Pol II TFIID

Inicjacja transkrypcji Pol II- budowa TFIID TBP – TATA-Binding Protein TAF - TBP-Associated Factors GTF – General Transcription Factor

Działanie enhancerów

Drożdżowy system dwuhybrydowy

Enhancery działają na odległość

Funkcja i rozmieszczenie izolatorów

Komplikowanie się obrazu transkrypcji Pol II

Szczeble regulacji transkrypcji

Dodawanie czapeczki na 5’ końcu transkryptu

Sekwencje rozpoznawane przez system splicingu

Mechanizm splicingu

Splicing alternatywny

Poliadenylacja 3’ końca m. RNA

Struktura 3’ szpilki w m. RNA histonów

NMD- Nonsense-Mediated Decay System degradacji nieprawidłowych m. RNA, zawierających PTC (Premature Terminantion Codon) - przedwczesne kodony terminacyjne translacji Ścieżka NMD wywiera bezpośredni wpływ na setki zaburzeń genetycznych w populacji ludzkiej. ¼ wszystkich znanych mutacji u człowieka indukuje NMD