Ribozymy mirka rovenskalfmotol cuni cz Ribozym n RNA

Ribozymy mirka. rovenska@lfmotol. cuni. cz

Ribozym: n RNA s katalytickou aktivitou n Zvyšuje rychlost a specifitu: štěpení fosfodiesterové vazby syntézy peptidové vazby Ø Ø § Přirozený výskyt: od virů po člověka

n Za objev, že RNA se v buňkách nejen podílí na přenosu dědičných vlastností, ale vystupuje též jako biokatalyzátor, byla r. 1989 udělena Nobelova cena za chemii Sidneymu Altmanovi (USA) a Thomasi Cechovi (USA) S. Altman T. Cech

Přirozeně se vyskytující ribozymy

Ribozym x (proteinový) enzym n RNA je vystavěna jen ze 4 různých bází, zatímco proteiny obsahují 20 různých aminokyselin omezenější počet možných katalytických mechanismů u ribozymů ve srovnání s proteiny n Vysoká hustota záporného náboje a lokalizace bází do vnitřku duplexů (vzniklých párováním bází) rovněž spoluurčují možné katalytické mechanismy (ovlivňují možné kontakty, terciární strukturu…)

Ribozym & (proteinový) enzym n Způsoby katalýzy se přesto obecně zdají podobné: RNA i proteinový enzym využívají kyselé/zásadité skupiny resp. ionty kovů k aktivaci nukleofilního činidla a stabilizaci náboje odstupující skupiny n Pro funkci ribozymu je rovněž nezbytné vytvoření určité sekundární a terciární struktury RNA (párováním bazí komplementárních úseků RNA řetězce); stejně tak je důležitá určitá primární struktura určitých úseků n Četné ribozymy mohou rychlost reakce zvýšit až 103 -1011 x (HDV ribozym štěpí fosfodiesterovou vazbu stejně rychle jako proteinový enzym RNasa)

1. Metaloribozymy a) Ribonukleasa P n RNasa P katalyzuje místně specifickou hydrolýzu prekurzorové t. RNA, kterou se tvoří funkční t. RNA n V bakteriích i eukaryotech (včetně člověka) n Katalytická aktivita závisí na přítomnosti dvoumocných iontů kovu (Mg 2+, Mn 2+) n Velký ribozym, obsahuje RNA i protein, ale vlastním katalyzátorem je RNA

n n Hydroxidový iont resp. hydroxyl koordinovaný iontem kovu napadá atom fosforu fosfodiesterové vazby, která se štěpí Ionty kovů se patrně podílejí na tvorbě aktivního nukleofilu, stabilizaci vznikajícího negativního náboje…

1. Metaloribozymy b) Self-splicing introns (samosestřih) n Velké introny (> 200 nukleotidů), které jsou schopny se samy vyštěpit z primárního transkriptu n U bakterií i eukaryot (např. v pre-RNA prvoka Tetrahymena, v primárních transkriptech mitochondriálních genů kvasinek …)

Splicing (sestřih) n n Introny = nekódující segmenty RNA, které jsou roztroušeny mezi oblastmi budoucí m. RNA kódujícími protein (exony) Před translací musí být introny odstraněny a exony se spojit ve funkční m. RNA Genomická DNA oblast promotoru exon 1 intron 1 exon 2 intron 2 exon 3 intron 3 transkripce Pre-m. RNA (hn. RNA) Funkční m. RNA 1 2 3 splicing 1 2 3

Self-splicing x splicing n Některé introny se mohou z primárního transkriptu vyštěpit samy, bez jinak obvyklé účasti spliceosomu (komplex RNA a proteinů / enzymů – např. helikasa) n I když self-splicing proběhne i bez účasti proteinů, bylo zjištěno, že in vivo často probíhá za přítomnosti určitých proteinů, které zvyšují efektivitu splicingu (např. stabilizují potřebnou strukturu) n Self-splicing introns na rozdíl od proteinových enzymů zprostředkovávají jen jedno kolo úpravy

Self-splicing introns: Ø Ø n Introny skupiny I: self-splicing je zahájen nukleofilním atakem OH-skupiny exogenního guanosinu (navázaného v konkrétním místě vodíkovými vazbami) na fosfodiesterovou vazbu Introny skupiny II: atakujícím nukleofilem je 2´-OH konkrétního adenosinu, který je součástí intronu Ionty kovů (Mg 2+, Mn 2+) by mohly: podporovat tvorbu správné struktury aktivního místa, orientovat substrát, aktivovat nukleofil deprotonací 2´-OH guanosinu a stabilizovat záporný náboj

Introny skupiny I: atak exogenního guanosinu n n 3´-OH exogenního guanosinu atakuje fosfodiesterovou vazbu v 5´-místě sestřihu; tato vazba se štěpí a GMP se připojuje na 5´-konec intronu… 1. transesterifikace Uvolněný 3´-konec exonu pak napadá esterovou vazbu v 3´místě sestřihu; intron se uvolní a oba exony se spojí … 2. transesterifikace (viz následující obrázek)

Introny skupiny II vazebné místo pro guanosin exon 1 G napadá fosfodiesterovou vazbu v 5´-místě sestřihu exon 2 štěpení mezi 3‘ koncem exonu 1 a 5‘-koncem intronu koncová 3‘OH exonu 1 napadá a štěpí fosfodiesterovou vazbu v 3‘-místě sestřihu exony jsou spojeny, intron se uvolní p…fosfát vnitřní adenosin vnitřní A napadá fosfodiesterovou vazbu v 5´-místě sestřihu

Jak je důležité mít správnou strukturu: n Ø Ø Správná primární, 5´-místo sestřihu sekundární a terciární struktura je důležitá pro: rozpoznání vazebného místa pro guanosin rozpoznání míst štěpení místo rozpoznávané guanosinem (místo 1. ataku) spárované báze vazebné místo pro guanosin vlásenka se smyčkou 3´-místo sestřihu

Vlásenka – 3 D páteř báze uvnitř

n Self-splicing introns na rozdíl od proteinových enzymů zprostředkovávají jen jedno kolo úpravy (své vyštěpení) n ALE: když je intron skupiny I už vyštěpen, může fungovat jako skutečný enzym: opakovaně rozpoznávat komplementární sekvenci jiné molekuly RNA (pomocí tzv. internal guide sequence, IGS), napadat ji 3´-OH skupinou navázaného guanosinu a katalyzovat její štěpení

RNA (substrát) (intron skupiny I po vyštěpení) ribozym napadající substrátovou RNA

Potenciální terapeutické využití intronů skupiny I n Můžeme (in vitro) konkrétním způsobem změnit IGS, a tak vytvořit ribozymy, které štěpí, tj. ničí, požadovanou molekulu RNA…testováno jako možná nová terapeutická metoda humánní medicíny n V současné době je testován syntetický ribozym, který likviduje m. RNA pro receptor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). VEGF stimuluje angiogenezi, takže zablokování jeho působení by mohlo připravit vyvíjející se nádor o potřebné krevní zásobení

2. Malé ribozymy viroidů a satelitů Ø Ø Ø n n Hammerhead Hairpin HDV (hepatitis delta virus) Satelity: subvirové agens, kterým chybí geny pro enzymy potřebné pro jejich replikaci; jejich pomnožení je závislé na hostitelské buňce a na koinfekci tzv. pomocným virem Ribozym je součástí větší RNA (viroidu nebo satelitu), která je replikována hostitelskými RNA-polymerasamy Produkt této replikace se štěpí účinkem ribozymové aktivity na jednotlivé molekuly RNA Ty pak mohou být ligovány do cirkulární podoby (opět aktivitou ribozymu)

cyklický fosfát! n n n Ribozym katalyzuje nukleofilní atak 2´-hydroxylu na sousední 3´-fosfát, takže produktem je i 2´-3´ cyklický fosfát Zdá se, že jde o acidobazickou katalýzu: 2´-OH vedle štěpené vazby je aktivován pro nukleofilní atak odejmutím protonu nějakou zásadou. Souběžně je jiný proton poskytnut pro stabilizaci záporného náboje vzniklého na odstupujícím kyslíku Podobné reakcím katalyzovaným proteinovými enzymy RNasami

Hammerhead

n Ribozymy hammerhead a hairpin se nacházejí v satelitních RNA resp. viroidech infikujících rostliny (např. v satelitní RNA rostlinného viru tobacco ringspot virus) X n HDV je lidský patogen: koinfekce HDV s HBV je vážnější a komplikovanější než infekce samotným HBV

3. Ribosom je ribozym n Tvorba peptidové vazby je katalyzována 23 S r. RNA, která je součástí velké podjednotky ribosomu: translace

n Peptidyltransferasová aktivita může být zvýšena jistým proteinem (L 27), přesto ale lze tuto aktivitu (i když nižší) pozorovat i v jeho nepřítomnosti n Ačkoli tento protein usnadňuje tvorbu peptidové vazby, není pro ni nezbytný

Jak RNA katalyzuje tvorbu peptidové vazby? n Párování bází mezi CCA na konci t. RNA v P a A místech a 23 S r. RNA napomáhá správné orientaci aminoskupiny aminoacyl-t. RNA pro reakci s karbonylem rostoucího polypeptidu n Navržen (ale nepotvrzen) je i další mechanismus: totiž že kyslík v pozici 3´ terminálního adenosinu v koncovém CCA tripletu peptidyl-t. RNA odnímá vodík z 2´-OH a v důsledku toho zase kyslík v pozici 2´ odnímá vodík z aminoskupiny aminoacyl-t. RNA, která pak napadá karbonyl v peptidyl-t. RNA

Hypotéza o „světě RNA“ n Hypotéza: RNA původně sloužila jako genetický materiál i jako katalyzátor; až během evoluce katalytickou funkci mnoha molekul RNA převzaly proteiny n Kationtové jíly (montmorillonit) možná mohly napomáhat polymerizaci jednotek podobných monomerům dnešní RNA a tvorbě řetězců „RNA“ n Dokonce i v nepřítomnosti enzymů by tedy mohla být jednořetězcová RNA schopna vytvářet kopie RNA pomocí templátem řízené polymerizace a aktivovaných nukleotidů n In vitro byly vyselektovány nové, syntetické ribozymy, které vykazují široké spektrum katalytických aktivit a mohou používat jen 3 nukleotidy (A, G, U)