Replicao do DNA Agradecimentos Profa Dra Aline Maria

Replicação do DNA Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry (3 a. Ed. )

Replicação do DNA O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA. A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases

A replicação do DNA é semi-conservativa Cultivo em meio 15 NH 4 Cl Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958 Cultivo em meio 14 NH 4 Cl Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de Cs. Cl

A replicação é bidirecional

A replicação do cromossomo circular

Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação Replicon: 1. Origem + Término 2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 3. O genoma de uma célula procariótica constitue um único replicon 4. Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente

A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado

O genoma bacteriano circular constitue um único replicon A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000 pb/min Um única origem de replicação em E. coli (Ori. C, 245 pb)

Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação

O genoma eucariótico constitue vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000 pb/min Os replicons eucarióticos tem 40 -100 kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6 hrs em uma célula somática

Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas

Fita contínua (líder) Fita descontínua

Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3´OH da cadeia em crescimento. O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato Sentido da síntese sempre é 5’ 3’ A replicação é um processo extremamente fiel. As DNApolimerases tem atividade revisora

Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor) Fita sendo polimerizada Fita molde

As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado

Pareamento de bases correto incorreto

Atividade revisora 3’ 5’ garante a fidelidade da replicação

Modelo da estrutura das DNA-polimerases

Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol I + + + Pol. II + + - Número de subunidades Tamanho em k. Da 1 103 4 90 10 ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16 -20 40 250 -1000 Polimerização 5’ 3’ Exonuclease 3’ 5’ Exonuclease 5’ 3’ Processividade 3 -200 (nt adicionados antes da dissociação do molde) 1500 Pol. III + + - 500000

DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica

A subunidade Beta da DNA -polimerase III envolve o duplex das fitas-filhas

Ori. C do cromossomo de E. coli

Proteínas presentes na origem de Replicação de E. coli Dna. A Reconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos Dna. B (helicase) Desenrola o DNA Dna. C Auxilia a ligação de Dna. B na origem HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação Primase (Dna. G) Sintetiza os primers de RNA Single strand binding Liga a fita simples de DNA (SSB) RNA polimerase Facilita a ação da Dna. A DNA girase Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita Dam Metilase Metila as sequências GATC na Ori. C

A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA Síntese da Fita descontínua Fita contínua Síntese da Fita Contínua

Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas A DNA ligase sela as quebras

A DNA ligase sela as quebras

Mecanismo de ação da DNA ligase

Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E. coli SSB Liga a fita simples de DNA Dna. B (helicase) Desenrola o DNA Primase (Dna. G) Sintetiza os primers de RNA DNA Polimerase III Sintese da fita nova DNA Polimerase I Preenche as lacunas e excisa os primers DNA Ligase Liga os fragmentos DNA girase Superenrolamento

Síntese das fitas contínua e descontínua é independente

O complexo de replicação A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha Cada core catalítico da DNA Pol. III sintetiza uma das fitas-filhas O primossomo afasta uma das fitas molde Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas

Duplicação dos cromossomos Separação dos cromossomos e divisão celular