REPLICACIN DEL MATERIAL GENTICO Replicacin l El ADN

REPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO Replicación l. El ADN es la macromolécula depositaria de la información ADN genética. l. Metabolismo de la información: procesos que intervienen en el almacenamiento, recuperación, procesamiento y transmisión de la información genética (Figura 1). Los principales procesos de este metabolismo son: la replicación (el ADN, o ARN en algunos virus, actúa de molde para su propia síntesis), la transcripción (la información codificada en el ADN determina la estructura de los ARNs) y la traducción (el ARN actúa como molde para la síntesis de una proteína). Estos 3 procesos tienen en común la necesidad de un molde y el desarrollarse en 3 etapas centrales: iniciación, elongación y terminación. Transcripció ARN Traducción l. Tomaremos como modelo E. coli. Proteína

CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO DE REPLICACIÓN DEL ADN 1)LA REPLICACIÓN DEL ADN ESTÁ COORDINADA CON EL CICLO DE CRECIMIENTO Y DIVISIÓN CELULAR. 2)LA REPLICACIÓN ES SEMICONSERVATIVA l l Según Watson y Crick las dos cadenas del ADN son complementarias y cada una actúa como molde para la síntesis de la hebra complementaria, da lugar a dos moléculas de ADN duplohelicoidal idénticas al ADN original, de modo que cada ADN contiene una hebra vieja y una nueva. Este postulado fue confirmado por Stahl en 1957: cultivaron durante varias generaciones E. colicon N 15, de modo que todos los componentes nitrogenados de la célula contendrían N 15 y por tanto al centrifugar en gradiente con cloruro de cesio tendrían mayor densidad de sedimentación el ADN marcado con N 15 y no con N 14. Posteriormente transfieren las bacterias al ADN con un medio con N 14, se extrae el ADN, se centrifuga en gradiente de cesio y se obtiene una banda con densidad de centrifugación interm. Edia que corresponde al ADN híbrido. Tras una segunda generación se repitió el experimento y se aisló el ADN y se centrifugó en gradiente de clouro de cesio obteniéndose una banda a medio caminno y una banda a elevado nivel o ADN ligero.

3) LA REPLICACIÓN COMIENZA EN UN PUNTO DE ORIGEN Y ES BIDIRECCIONAL: Se plantean a nivel de replicación una serie de interrogantes: - ¿Se desenrrollan totalmente las cadenas de ADN parental para que cada una sea replicada? - ¿Dónde comienza la replicación: en sitios al azar o en un punto único? - Si se inicia en un punto ¿se da en una dirección o en ambas?

- - - John Cairns proporcionó la primero indicación de que la preplicación es un proceso altamente coordinado en el que las dos hebras parentales se desenrrollan y se replican simultáneamente. Esta hipótesis se confirmó aislando y examinando el cromosoma de E. coli (bacteria que vive en nuestro intestino grueso y contienen un cromosoma circular y puede contener otros ADN en forma de plásmidos, que pueden contener más de una copia de 3 a 100 genes y pueden contener más de una copia una misma célula. Cairns cultivó E. coli durante una generación o 1, 5 generaciones en un medio con timidina tritiada. En la primera generación originó una progenie que contenía una hebra marcada radioactivamente y otra hebra no. La primera generación obtuvo bacterias y mediante autorradiografía examinó el ADN, su radioactividad reveló el cromosoma entero y la segunda revelaba ADN incorporado de novo. Al analizar la película fotográfica observó un nuevo lazo en forma de letra griega tedta. La zona de intersección entre las dos zonas responsables y no replicadas se llama horquilla de replicación. Para explicar si era mono o bidireccional se observó que la mayor radioactividad se sitaba en las dos horquillas de replicación, lo que indicaba que la replicación era bidireccional. Otros experimentos indicaron que la replicación se iniciaba en un punto único denominado Ori. C u origen de repliación. Es un gen de 245 pb con cuatro secuencias repetidas.

4) La síntesis de ADN transcurre en dirección 5´ 3´ y es semidiscontinua Las cadenas de ADN siempre son sintetizadas en la dirección 5´ 3´, siendo el 3´OH libre el punto de elongación del ADN. Debido a que las cadenas de ADN son antiparalelas, la cadena que actúa de molde es leída del extremo 3´ al 5´. Si la síntesis transcurre siempre en la dirección 5´ 3´, ¿cómo pueden sintetizarse simultáneamente las dos cadenas? Si las dos cadenas fuesen sintetizadas continuamente a medida que avanza la horquilla de replicación, una tendría que se sintetizada en dirección 3´ 5´. Este problema fue resuelto por Reiji Okazaki y col en la década de 1960, al descubrir que una de las cadenas es sintetizada en forma de trozos cortos, denominados fragmentos de Okazaki. Este trabajo condujo a la conclusión de que una de las cadenas es sintetizada de forma continua y la otra discontinua (Figura 4). La cadena continua o cadena conductora es aquella cuya síntesis en dirección 5´ 3´ transcurre en la misma dirección que el movimiento de la horquilla de replicación. La cadena discontinua o cadena rezagada es aquella cuya síntesis en dirección 5´ 3´ transcurre en dirección opuesta a la dirección del movimiento de la horquilla. Como veremos más adelante, la síntesis de la hebra conductora y rezagada están estrechamente coordinadas.

5) EL ADN ES SINTETIZADO POR LAS ADN POLIMERASAS

PROCESO GLOBAL DE REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS La síntesis de una molécula de ADN es un proceso muy complejo en el que participan, además de las ADNp, 20 o más enzimas y proteínas diferentes y que se puede dividir en tres fases: iniciación, elongación y terminación. Estas fases se distinguen por las reacciones que tienen lugar y por las enzimas implicadas y reflejan la información obtenida de experimentos en E. coli.

1. Iniciación La replicación del cromosoma de E. coli se inicia en una secuencia de origen denominada ori. C. Este origen consta de 245 pb y contiene secuencias muy conservadas entre los orígenes de replicación bacterianos. Las secuencias clave son dos series de repeticiones cortas: una de las series consta de tres repeticiones de una secuencia de 13 pb, con una cantidad abundante de A y T (puede desnaturalizarse con facilidad) y la otra serie está formada por cuatro repeticiones de una secuencia de 9 pb. (Figura. 10) En la fase de iniciación de la replicación participan al menos ocho enzimas o proteínas diferentes (tabla 2). Éstas se encargan de abrir la hélice del ADN en el origen y establecen un complejo precebador para las reacciones posteriores (Figura 11). El componente clave en el proceso de iniciación es la proteína Dna. A. Un complejo formado por unas 20 moléculas de proteína Dna. A se une a las cuatro repeticiones de 9 pb en el origen, a continuación reconoce y sucesivamente desnaturaliza el ADN en la región de las repeticiones de 13 pb. Este proceso requiere ATP y la proteína bacteriana HU, del tipo de las histonas, que facilita que el ADN se doble y desenrolle. Seguidamente, la proteína Dna. B se une a esta región, en una reacción que requiere la proteína Dna. C. Dos hexámeros de Dna. B, uno en cada horquilla, actúan de helicasa, desenrollando el ADN de manera bidireccional y creando dos horquillas de replicación potenciales. Simultáneamente muchas moléculas de la proteína de unión al ADN de cadena sencilla (SSB) se fijan de manera cooperativa al ADN, estabilizando las cadenas separadas e impidiendo su renaturalización. Otra enzima, la ADN girasa (una ADN topoisomerasa) alivia la tensión topológica creada por la Dna. B helicasa.

La iniciación es la única fase de la replicación que está regulada, de modo que sólo tenga lugar una vez cada ciclo celular. Incluso con el molde de ADN expuesto, no se puede sintetizar un nuevo ADN a menos que se construya un cebador. Recordemos que todas las ADNp conocidas necesitan un cebador con un grupo OH libre en el extremo 3´ para sintetizar ADN en dirección 5´ 3´. Kornberg descubrió que durante la replicación había sobre el ADN pequeñas cantidades de ARN. Este ARN, de entre 10 y 60 nucleótidos, es precisamente el que hace de cebador y es sintetizado por la enzima primasa (proteína Dna. G, que es una ARN polimerasa, las cuales, como veremos después, no necesitan cebador) y sobre el que la ADNp III añade desoxirribonucleótidos en la fase de elongación.

2. Elongación La fase de elongación consiste en dos operaciones distintas pero relacionadas: la síntesis de la hebra conductora y la síntesis de la hebra rezagada. La síntesis de la hebra conductora empieza con la síntesis del cebador de ARN por la primasa en el origen de replicación. A continuación la ADNp III adiciona desoxirribonucleótidos a este cebador. Una vez iniciada, la síntesis de la hebra conductora transcurre de manera continua, al mismo ritmo que el desenrollamiento del ADN en la horquilla de replicación. La síntesis de la hebra rezagada se realiza a trozos. Primero, un cebador de ARN es sintetizado por la primasa y, como en la síntesis de la hebra conductora, la ADNp III se une al cebador de ARN y añade desoxirribonucleótidos. A este nivel, la síntesis de los fragmentos de Okazaki parece sencilla, pero es en realidad muy compleja. Esta complejidad reside en la coordinación de la síntesis de las hebras conductora y rezagada, puesto que ambas hebras son producidas por un único dímero asimétrico de ADNp III. Para ello la hebra molde de la cadena rezagada forma un bucle para aproximar los dos puntos de polimerización y conseguir que las dos cadenas en síntesis tengan la misma polaridad.

La síntesis de los fragmentos de Okazaki pone en juego complejas actividades enzimáticas (Figura 13). La helicasa Dna. B y la primasa constituyen una unidad funcional dentro del complejo de replicación, denominada primosoma. La ADNp III usa un juego de subunidades núcleo (polimerasa núcleo) para la síntesis continua de la hebra conductora, mientras que el otro juego de subunidades núcleo circula entre un fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el bucle. A medida que el ADN es desenrollado por la helicasa Dna. B en la horquilla de replicación, la primasa ocasionalmente se asocia con la helicasa Dna. B y sintetiza un corto cebador de ARN. Una nueva abrazadera deslizante β es entonces posicionada en el cebador por el complejo cargador de la abrazadera de la ADNp III. Cuando se ha completado la síntesis de un fragmento de Okazaki, la replicación se detiene y las subunidades núcleo de la ADNp III se disocian de su abrazadera deslizante y se asocian con la siguiente. Ello inicia la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki. EL proceso permite la síntesis de unos 1000 nucleótidos por segundo en cada hebra. Una vez finalizada la síntesis de un fragmento de Okazaki, su cebador es eliminado y reemplazado con ADN por la ADNp I (actividad exonucleasa 5´ 3´ y polimerasa, respectivamente) y la mella restante es sellada por una ADN ligasa (Figuras 14 y 15). La ADN ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un OH 3´, al final de un fragmento, y un fosfato 5´ al final de otro fragmento. La energía necesaria se obtiene acoplando la reacción a la escisión de NAD+ (E. coli y otras bacterias) o de ATP (eucariotas y algunos virus).

3. Terminación Finalmente, las dos horquillas de replicación del cromosoma circular de E. coli se encuentran en una región terminal que contiene múltiples copias de una secuencia de 20 pb denominada Ter (por terminal). Las secuencias Ter actúan en el cromosoma como una especie de trampa donde una horquilla de replicación puede entrar pero no salir (Figura 16). Las secuencias Ter son lugares de unión para una proteína denominada Tus (por sustancia de utilización del terminal en inglés). El complejo Ter-Tus puede detener la replicación desde una sola dirección. Sólo actúa un complejo Ter-Tus por ciclo de replicación. Cuando una horquilla de replicación topa con un complejo Ter. Tus se detiene; la otra horquilla se detiene cuando encuentra a la primera ya detenida. Los pocos centenares de pares de bases finales entre estos grandes complejos proteicos son replicados a continuación mediante un mecanismo aún desconocido. El resultado son dos cromosomas circulares ligados en el espacio. Los círculos de ADN unidos de este modo se denominan concatenados; su separación requiere, en E. coli, una topoisomerasa. Los cromosomas separados son segregados en las células hijas en la división celular.