Rel laika PCR Kaspars Megnis 2013 PCR Interesjo

Reālā laika PCR Kaspars Megnis 2013

PCR • Interesējošā DNS tiek savairota tik lielā daudzumā, ka piemaisījumi netraucē izpēti. • Var pavairot DNS fragmentu no dažiem bp līdz veseliem genomiem un vēl vairāk.

PCR reakcijas sastāvs • Paraugs (pavairojamais DNS). • Sāļi (darbojas kā reakcijas katalizatori). • Nukleotīdi (nukleīnskābju sastāvdaļas- timīns [T], citozīns [C], guanīns [G] un adenizīns [A]). • Praimeri (īsi DNS/RNS fragmenti, kas palīdz polimerāzei sākt DNS/RNS sintēzi). • Polimerāze (enzīms, kas replicē DNS/RNS).

PCR

PCR reakcijas norise Denaturācija (kausēšana). Paaugstinātā to atdalās DNS dubultspirāles pavedieni. Praimeru piesaistīšanās. Polimerāzes piesaistīšanās un jaunā pavediena sintēze.

4. cikls mērķa gēns 3. cikls 2. cikls DNS paraugs 1. cikls 2 2 2 3 2 4 2 5

Cikls Kopiju skaits 1 4 13 16384 25 67108864 2 8 14 32768 26 134217728 3 16 15 65536 27 268435456 4 32 16 131072 28 536870912 5 64 17 262144 29 1073741824 6 128 18 524288 30 2147483648 7 256 19 1048576 31 4294967296 8 512 20 2097152 32 8589934592 9 1024 21 4194304 33 17179869184 10 2048 22 8388608 34 34359738368 11 4096 23 16777216 35 68719476736 12 8192 24 33554432

PCR pielietojums Pielietojums: • • • kvalitatīva DNS pavairošana; infekciju slimību diagnostika; tiesu medicīna; mutāciju detektēšana; ĢMO detektēšana; . . .

PCR produkta vizualizēšana / kvantificēšana agarozes gēlā • Vāja precizitāte (etīdija bromīda krāsošana spēj izšķirt tikai lielas daudzuma atšķirības). • Relatīvi zema jutība (nepieciešams liels daudzums izejmateriāla). • Šaurs dinamiskais diapazons (mērķa molekulu izejas koncentrācijas izmaiņu diapazons, kurā iegūtais rezultāts ir precīzs / ticams (<2 log)). • Iegūtais rezultāts nav kvantitatīvs (ir datorprogrammas, kas spēj zonu spilgtumu pārvērst skaitļos, bet ar zemu precizitāti).

PCR produkta vizualizēšana / kvantificēšana agarozes gēlā

Reālā laika PCR (q. PCR)

Reālā laika PCR (q. PCR) – kādēļ? Nepieciešamība kvantitatīvi raksturot konkrētas m. RNS (k. DNS) vai g. DNS daudzumu paraugos. ü Teorētiski eksistē tieša sakarība starp PCR amplifikācijas ciklu skaitu, pie kura tiek sasniegta amplifikācijas eksponenciālā fāze un sākotnējo mērķa molekulu koncentrāciju paraugā. ü Praktiski attiecība nav gluži lineāra, jo reakcijas efektivitāti ietekmē reakcijas procesa īpatnības, reaģentu daudzums, parauga īpatnības, praimeru struktūras. . .

Reālā laika PCR • Mērķa gēnu paraugu daudzuma pieaugums tiek vērots reakcijas laikā – katrā PCR ciklā. • Tiek izmantotas fluorescentas (molekulas spēja emitēt gaismu pēc tam, kad tā ir absorbējusi cita viļņu garuma elektromagnētisko starojumu) DNS krāsvielas/iezīmes kas spīd, ja ir saistījušās pie DNS fragmenta un ir notikusi amplifikācija. • Amplifikācija un detektēšana notiek vienlaicīgi.

DNS + Master. Mix (sāļi, nukleotīdi, polimerāze, fluorescējošās iezīme) + praimeri q. PCR reakcija (fluorescences detekcija) datu analīze

fluorescējošās iezīmes Fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcija Fluorescējošās krāsvielas • Oxazole Yellow • SYBR green • Pico. Green datu analīze Hibridizācijas zondes • Light Cycler Hidrolīzes zondes • Taq. Man • Molekulārās bākas • Molekulārie skorpioni

fluorescējošās iezīmes Fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcija Fluorescējošās krāsvielas • Oxazole Yellow • SYBR green • Pico. Green datu analīze Hibridizācijas zondes • Light Cycler Hidrolīzes zondes • Taq. Man • Molekulārās bākas • Molekulārie skorpioni

fluorescējošās iezīmes SYBR GREEN (fluorescējoša krāsviela) • ds. DNS saistoša krāsviela. • Emitē spēcīgu fluorescējošu signālu, kad saistījusies ar ds. DNS. q. PCR reakcija • Detektē sākot no 1000 molekulām. Izmanto: datu analīze • Analīzēs, kur nav vajadzīgs tik liels specifiskums, kā zondu analīzēs. • Vispārējai reakcijas efektivitātes pārbaudei pirms zondu analīzes.

fluorescējošās iezīmes SYBR GREEN (fluorescējoša krāsviela) • Nespecifiska saistīšanās - var saistīties pie jebkura ds. DNS (praimeru dimēri, nespecifiski amplificētas ds. DNS). q. PCR reakcija • Reakcijas beigās nepieciešama disociācijas līknes analīze (lai konstatētu iespējamu nespecifisku saistīšanos). • Garāks fragments rada spēcīgāku signālu. datu analīze

fluorescējošās iezīmes FRET princips Fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcija Fluorescējošās krāsvielas • Oxazole Yellow • SYBR green • Pico. Green datu analīze Hibridizācijas zondes • Light Cycler Hidrolīzes zondes • Taq. Man • Molekulārās bākas • Molekulārie skorpioni

fluorescējošās iezīmes FRET princips (fluorescences rezonanses enerģijas pārnese) q. PCR reakcija • FRET– pēc apstarošanas ierosinātā molekula lielāko daļu enerģijas atdot blakus esošajai molekulai, kuras ierosināšanas enerģija ir ļoti līdzīga pirmās molekulas izdalītajai. datu analīze • Nepieciešami nelieli attālumi (pm – nm) starp donoru un akceptoru.

fluorescējošās iezīmes Fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcija Fluorescējošās krāsvielas • Oxazole Yellow • SYBR green • Pico. Green datu analīze Hibridizācijas zondes • Light Cycler Hidrolīzes zondes • Taq. Man • Molekulārās bākas • Molekulārie skorpioni

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) 20 -30 bp gari oligonukleotīdi (ss. DNS). 5’ galā ir fluorescenta iezīme – reportieris (R). 3’ galā ir fluorescences dzēsējs (Q). q. PCR reakcija datu analīze

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze Kušana (95°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze Kušana (95°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze Kušana (95°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze Zondes piesaistīšanās (60°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze Zondes piesaistīšanās (60°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze Praimeru piesaistīšanās (60°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)

fluorescējošās iezīmes Taq. Man (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze DNS sintēze un zondes šķelšana (60°C)

fluorescējošās iezīmes Molekulārās bākas (hidrolīzes zondes) 5’galā ir fluorescenta iezīme – reportieris (R). 3’ galā fluorescences dzēsējs (Q). Dzēsējs tuvāk reportierim. q. PCR reakcija Mērķa sekvencei komplementāra tikai zondes vidusdaļa. Terminālie 10 – 15 nukleotīdi ir savstarpēji komplementāri. datu analīze Zondei kniepadatas struktūra.

fluorescējošās iezīmes Molekulārās bākas (hidrolīzes zondes) q. PCR reakcija datu analīze

fluorescējošās iezīmes Fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcija Fluorescējošās krāsvielas • Oxazole Yellow • SYBR green • Pico. Green datu analīze Hibridizācijas zondes • Light Cycler Hidrolīzes zondes • Taq. Man • Molekulārās bākas • Molekulārie skorpioni

fluorescējošās iezīmes Hibridizācijas zondes • Tās ir vienīgās zondes, kuras lietojot, tieši mēra FRET. • Reakcijas maisījumā ir 2 veidu zondes: ü donori, kam 3’ gals ir iezīmēts ar reportieri (FAM) – molekulas ir ierosinātas, ü akceptori , 5’ gals ir iezīmēts ar akceptora molekulu (TAMRA, ROX). q. PCR reakcija datu analīze

fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcijas norise Denaturācija (kausēšana). Paaugstinātā to atdalās DNS dubultspirāles pavedieni. q. PCR reakcija Praimeru piesaistīšanās. datu analīze Polimerāzes piesaistīšanās un jaunā pavediena sintēze.

fluorescējošās iezīmes Optiskā sistēma q. PCR reakcija datu analīze

fluorescējošās iezīmes Uz Real Time PCR balstītas metodes • Absolūtā kvantificēšana • Relatīvā kvantificešana • Genotipēšana (kvalitatīvi dati) q. PCR reakcija • CNV detekcija (kvantitatīvi dati) • Plus/mīnus detekcija (kvalitatīvi dati) • Reversā transkripcija (kvantitatīvi dati) datu analīze u. c.

fluorescējošās iezīmes Real Time PCR vs PCR q. PCR reakcija datu analīze

fluorescējošās iezīmes HRM (high resolution meltcurve) • Kombinē fluorescentu krāsu, kušanas līknes un statistiskās analīzes principus q. PCR reakcija • ds. DNS kušana atkarīga no GC satura, fragmenta garuma un sekvences • Vienas bāzes izmaiņa ir detektējama datu analīze • Pielieto: gēnu skanēšana, genotipēšana, DNS metilācijas analīze, DNS fingerprintings

fluorescējošās iezīmes HRM uzdevums q. PCR reakcija datu analīze Sekvence, kura satur mutantu nukleotīdu (G) kūst augstākā temperatūrā, nekā normālā sekvence.

fluorescējošās iezīmes PCR SNP genotipēšanas dati • Tiek izmantotas 2 Taq. Man zondes iezīmētas ar dažādām fluorescentajām krāsvielām. q. PCR reakcija • Atkarībā no SNP alēles viena zonde pie DNS saistās labāk nekā otra. datu analīze • Fluorescences intensitātes attiecība ļauj automātiski noteikt genotipu

fluorescējošās iezīmes q. PCR dati q. PCR reakcija datu analīze ü Slieksnis (treshold) - fluorescences intensitātes robeža, pēc kuras reakcija pāriet exponenciālajā fāzē

fluorescējošās iezīmes q. PCR dati q. PCR reakcija datu analīze ü CT (Cycle threshold) –cikls, pie kura PCR amplifikācija ir sasniegusi eksponenciālo fāzi.

fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcijas efektivitātes noteikšana Atšķaidījumi (1/3) q. PCR reakcija datu analīze

fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcijas efektivitātes noteikšana q. PCR reakcija datu analīze ü Ja reakcija ir 100% efektīva – jeb, ja katrā ciklā eksponenciālajā fāzē molekulu daudzums divkāršojas, - slīpumam jābūt apm -3, 33

fluorescējošās iezīmes Negatīvā kontrole q. PCR reakcija datu analīze ü Negatīvās kontroles tika aizmirstas - nevaram novērtēt rezultāta autentiskumu, lai gan duplikāti ir ļoti labi.

fluorescējošās iezīmes Negatīvā kontrole q. PCR reakcija datu analīze ü Negatīvās kontroles nav negatīvas - students ir sašķaudījis stobriņos – rezultāti nav interpretējami. ü Arī gēna duplikāti dod atšķirīgus rezultātus (ievieš kļūdu).

fluorescējošās iezīmes Negatīvā kontrole q. PCR reakcija datu analīze ü Negatīvās kontroles nav negatīvas - students ir sašķaudījis stobriņos, bet tomēr daudz mazāk, jo to fluorescence sasniedz slieksni daudz vēlāk nekā īstajā paraugā (normāli būtu, ja tās būtu detektējamas pie kāda 37 cikla, pie 29. tomēr nav labi). ü Duplikāti ir ļoti labi.

fluorescējošās iezīmes Disociācija Katrs paraugs tiek uzkarsēts ik pa 0. 1°C un tad mērīta fluorescence. SYBR Green krāsa spīd tikai tad, kad ir saistījusies ar ds. DNS, tādēļ pie noteiktas T° fluorescencei pazūd, jo fragments būs sadalījies par ss. DNS. q. PCR reakcija Vienāda garuma fragmenti disociēs pie vienas un tās pašas T°, kas būs novērojams kā krass fluorescences kritums. Dažāda garuma fragmenti disociēs pie dažādām T° un būs redzami vairāki fluorescences līmeņa kritumi, kas liecinās par nespecifiska fragmenta veidošanos reakcijā un ka dēļ tā rezultāts nav pilnīgi ticams. datu analīze

fluorescējošās iezīmes q. PCR reakcija datu analīze Fluorescences intensitātes apgriezta vērtība Disociācija

fluorescējošās iezīmes q. PCR dati Kvantificēšanas stratēģijas Absolūtā Mērķis: noteikt cik molekulu (pg) specifiskās DNS/m. RNS ir paraugā q. PCR reakcija Līdzekļi: standartlīkne, kas iegūta no DNS atšķaidījumiem ar precīzi zināmu koncentrāciju Rezultāts: m. RNS, DNS kopijas/g audu, /ml asiņu u. c. datu analīze Pielietojums: GMO, vīrusu titra noteikšana u. c. Relatīvā Mērķis: salīdzināt gēna ekspresijas līmeni dažādos paraugos vai noteikt cik reižu atšķiras divu gēnu ekspresija paraugos Līdzekļi: mērķgēna ekspresijas līmeņa normalizēšana pret references gēna/-u ekspresijas līmeni Rezultāts: X-reižu atšķirīgs ekspresijas līmenis dažādos paraugos Pielietojums: gēnu ekspresijas pētījumi

fluorescējošās iezīmes q. PCR dati Relatīvā kvantificēšana 1) Ct MG 1 audi 1 – Ct MG 1 audi 2 = delta. Ct 2) Q MG 1 audi 1/audi 2 = 2 delta. Ct q. PCR reakcija • Normalizācijas stratēģijas: datu analīze – Pret references gēnu – Pret normalizācijas faktoru 3) Qn = Q MG 1/ Q Ref. G vai NF

Real Time PCR + 1. Nav nepieciešama fragmentu pēcreakcijas vizualizācija gēlā. 2. Datorizēta datu analīze. 3. Īsāks analīzes laiks (2 soļu reakcija). 4. Pietiek ar 1000 X mazāk (k, g)DNS (ļoti jutīga). 5. Kvantitatīvi ļoti precīza - spēj detektēt 1. 1 X mērķmolekulu daudzuma atšķirības. 6. Plašs dinamiskais diapazons – līdz pat 10 log. 7. Specifiskā produkta amplifikācijas pārbaude ar disociācijas līknes metodi (precīza izšķirtspēja).

Real Time PCR 1. Dārgāka aparatūra 2. Dārgāki reaģenti 3. Vairāku gēnu amplificēšanai vienlaicīgi nepieciešams rūpīgs plānojums un bieži neveiksmīgs rezultāts 4. Reakcijas sagatavošana prasa lielāku uzmanību un rūpību (īpaši kvantificēšanas eksperimentiem)