Regulace mitosy a replikace DNA a jej souvislost

Regulace mitosy a replikace DNA a její souvislost s degradací cyklinů (ponenáhlu se dotýkáme výstupů) vstupy velikost signály poškození. . . výstupy gen. exprese morfogeneze. . .

(B. Němec, 1900? )

Co vlastně dělá „MPF“? Naivní model: MPF G 2/metafáze MPF metafáze/anafáze . . . ale je to složitější!

Standardní mitosa (živočišné buňky) profáze metafáze anafáze B anafáze A telofáze

Pučivá kvasinka – co poznáme? Ana. B/Telo S Meta/Ana. A

Rostlinnou mitosu lze chápat jako variaci

cortical array preprophase band fragmoplast spindle

Ceratium sp. . ale najdou se i zajímavější (Dinoflagellata!) („permanentně kondenzované chromozómy“)

Jaderná membrána přetrvává, chromozómy stále „kondenzovány“ a vázány k ní, vřeténko „vně“. . . Tedy: co následuje, nemusí být univerzální (možná ani u Opisthokont!)

Úloha CDK-cyklinových komplexů: co je třeba pro vstup do mitosy (G 2/M)? • Aktivace CDK vazbou „mitotických cyklinů“ (CLB, Cyc. A/B), tedy degradace CKI a cyklinů předchozí vlny • Aktivace CDK fosforylací T 161 • Dereprese CDK defosforylací T 14, Y 15 Jak jsou kontrolovány další kroky. . . a jak se oddělují chromatidy?

Rekapitulace: • Obnova CLN kinázy stabilizuje CLB. • Model!

Mají „cyklové hodiny“ trojtaktní motor? (C KI no ne ) CLN CLB

Co je „destruction machinery“? . . . opět proteasom + E 2/E 3!

Alternativní E 3: APC – anaphase promoting complex (Cdc 4) F S C (Cdc 53)

Další role APC: separace chromosomů Sesterské chromatidy drží pohromadě kohesinové komplexy. SMC (structural maintenance of chromosomes) SCC (sister chromatid cohesion) místo proteolyt. štěpení (C. H. Haering)

Dekoheze: • Fosforylace kohesinů – kinázy skupiny Polo (Plk), Aurora • Štěpení zbylých zprostředkováno APC!!

Shugoshin: ochrana centromeric. kohesinů?

Mitosa vs. meioze • meiotické kohesiny (vydrží Ana I, lépe stabilizovány Shugoshinem? ) • variantní proteinové komplexy centromer (monopolární přichycení k vřeténku)

Amatomie APC/cyklosomu (cyclosome) • Podjednotky: Cdc 16, Cdc 23, Cdc 26, Cdc 27, Bim. E + 3 další • Regulace: Cdc 20 nebo Cdh 1 – Cdc 20 sám degradován via APC – Cdh 1 je substrátem CDK (inaktivační P ace!) m. ND fenotyp

APC i regulátory lze najít i u rostlin Tarayre et al. 2004

Aktivace APC – zjednodušeně: Polo, Cdc 5, Aurora etc. (kinázy)

Regulace APC pomocí CDK, Cdc 20 a Cdh 1 mitotic CDK Polo, Cdc 5, Aurora etc. APC Cdc 20 APC P (active) APC P (inactive) autoinhibice APCCdc 20 Cdh 1 mitotic CDK Cdh 1 APC (active) mitotic CDK APCCdh 1 P

Jaký to má smysl? ? Cdc 20 anafáze APC P (active) APC P (inactive) Cdh 1 mitotic CDK telofáze/G 1 Cdh 1 APC (active) P

Co přepíná mezi oběma mody? Cdc 14 protein fosfatáza! (fenotyp jako Cdc 15) APC P (inactive) Cdc 14 Cdh 1 mitotic CDK Cdh 1 APC (active) P

Mitotic exit network (MEN) a role Cdc 14, Cdc 15. . . • CDC 14: dual specifity protein phosphatase. • až do anafáze inaktivní, v jadérku, vázána na inhibitor Cfi 1/Net 1 • uvolnění fosforylací inhibitoru fosfatáza GAP GTPáza GEF kináza

Fourteen Early Anaphase Release (FEAR) network. • Role v přechodné aktivaci Cdc 14 v časné anafázi • zahrnuje opět Polo kinázy

P. S. : co degraduje CLN?

Replikace DNA a její regulace

Regulace replikace spřažena s transkripcí! (histony, RNR etc. ) . . . což není překvapující (předn. 4)

Klíčovou úlohu mají replikační počátky. Proč se počátky replikují právě jednou za cyklus?

ARS versus počátek replikace in vivo autonomous replicating sequence Přímá vizualizace: DNA combing (Lebofsky and Bensimon 2002)

. . . ale jde to i méně sofistikovaně 1. - Et. Br 2. + Et. Br (Fangman et al. )

Každý ORI má své cykliny Model of the Ability of B-Type Cyclins to Promote S Phase and Activate Replication Origins(A), (B), and (C) show time lines (not to scale) representing the cell cycle in CLB, clb 5, and clb 5 clb 6 strains, respectively. Arrows indicate the time of bud emergence during the cell cycle, and the duration of S phase in each case is drawn as an open box. Firing of the various replication origins is shown by shaded circles. Light shading represents origins activated early in S phase, and darker shading those origins activated later. Hatched bars represent the proposed capability of different Clb. Cdk 1 p activities to promote timely firing of early and late replication origins. (Donaldson et al. 1998)

Trvání eukaryotního BC - příklady • Saccharomyces - v bohatém médiu 1, 5 -2 h • Drosophila: 6 min až 10 hod M M M S S G 2 6 min G 1 G 2 S 10 h . . . zde používány specifické embryonální ORI!

Replikační počátek váže řadu proteinů (De. Pamphilis 2003)

Cdc 6 (S. cer. ), cdc 18+ (S. p. ) Mutace S. cerevisiae S. pombe t. s. G 1 arrest overexprese delece „overreplication“ „haploidní mitosa“ . . . a exprese je regulovaná (S. Piatti et al. )

Haploidní mitosa v buňkách bez Cdc 6

Chromosomy se rozcházejí náhodně! (Piatti et al. , EMBO J. 1995)

Je Cdc 6 „licensing factor“? (Rao and Johnson)

Cdc 6 jakožto transientní „licensing factor“

Je Cdc 6 jedinou překážkou rereplikace? APC? ? ? (Piatti et al. 1997)

Ale to, co se rereplikuje, není jaderná DNA! Pozor na interpretaci, a na mitochondrie!!

Kontrola replikace: 2 stavy ORC APC CLB-CDK anafáze Cdc 6, Mcm S-fáze CLB-CDK Sic 1 prereplikační Cdc 34 CLN-CDK postreplikační