Regolatori del metabolismo Regolatori delle funzioni cellulari Funzionalit

• Regolatori del metabolismo • Regolatori delle funzioni cellulari • Funzionalità delle membrane • Cofattori enzimatici • Molecole semplici ma spesso non abbastanza per essere sintetizzate chimicamente • Presenti soprattutto nei vegetali e microrganismi • Additivi per alimenti e mangimi • Uso farmaceutico • Produzioni: v. Estrazione (organi, tessuti, cellule batteriche) v. Sintesi chimica v. Microrganismi mutanti/ricombinanti v. Produzioni miste

• In natura viene sintetizzata de novo solo da batteri e archea • Non sintetizzata da funghi e piante • Utilizzata ma non sintetizzata dagli animali (assimilata nel tratto gastrointestinale) • Struttura troppo complessa per sintesi chimica (70 reazioni)

RUOLO DELLA B 12 NEI BATTERI • Trasferimento di gruppi metilici (sintesi di acetil. Co. A nei batteri acetogenici e trasferimento di gruppi metilici nei batteri metanogeni) • Riduzione di ribonucleotidi a deossiribonucleotidi (sintesi DNA) • Ossidoriduzione interna di polialcoli con produzione di acil. Co. A e alcoli (batteri enterici)

RUOLO DELLA B 12 NELL’UOMO Cofattore di due soli enzimi: • Metil malonil Co. A mutasi (degradazione aminoacidi e/o lipidi metilmalonil. Co. A succinil. Co. A TCA) • Metionina sintasi (omocisteina + CH 3 -THF metionina + THF) • L’anemia perniciosa sarebbe una malattia autoimmune contro il fattore che permette l’assimilazione della vitamina e conseguente carenza ORIGINE DELLA B 12 Potrebbe essere stata originata nei primi batteri (atmosfera anossica, RNA world): da essa si sono evoluti i siroemi (redox di inorganici) e poi l’eme e la clorofilla (mondo ossigenico) relegandola ad un mondo di nicchia

PRODUZIONE PER VIA FERMENTATIVA • Prodotta esclusivamente per via fermentativa • Diversi batteri produttori (tabella) • Miglioramento ceppi per mutagenesi e selezione (100 volte incremento) o per ingegneria genetica (amplificazione operoni, promotori forti: 20 -30% incremento)

Estrazione dalla biomassa Purificazione per estrazione con solventi e cromatografia a seconda del grado di purezza richiesto (additivo o farmaco)

• Essenziale per l’uomo • Prodotto da piante e animali (ma non dai procarioti) • Funzione: • cofattore di attività enzimatiche • antiossidante (reagisce con forme attive di ossigeno) • Produzione: circa 100. 000 tonn/anno (6 -8 $/kg) • Uso: • 50% vitamina • 25% additivo alimentare • 15% additivo a bevande • 10% additivo a mangime • 1933: sintesi chimica • 1934: processo Reichstein (Chimicobiochimico)

6 passaggi chimici 1 passaggio biochimico (ossidazione regioselettiva D-sorbitolo D-sorboso) Vantaggi: • rese elevate (50%) • substrato di partenza economico (D-glucosio)

E’ possibile produrre acido ascorbico completamente per via fermentativa? I procarioti NON producono A. ascorbico ma producono gli intermedi del processo 2 processi alternativi possibili: • via del D-sorbitolo • via del 2, 5 diketogulonato

VIA del SORBITOLO • Utilizza le attività PERIPLASMATCHE deidrogenasiche di Gluconobacter oxydans • Rese teoricamente elevate grazie al trasporto nel citoplasma non necessario • Problema di compartimentazione della sorbosone deidrogenasi (l’unica citoplasmatica): soluzione con ceppi ingegnerizzati che esprimono sorbosone deidrogenasi eterologhe periplasmatiche DH DH DH D-sorbitolo L-sorbosio L-sorbone 2 keto L-gulonico

D-Sorbitol

VIA del 2, 5 Di. Keto. Gulonato (2, 5 DKG) • Non ci sono batteri in grado di effettuare tutto il processo (glucosio ascorbato) • Batteri in grado di trasformare il glucosio in 2, 5 Di. Keto. Gluconato (Acetobacter, Gluconobacter, Erwinia) • Batteri con 2, 5 DKG reduttasi (Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacterium): 2, 5 DKG 2 KG • Processo a due fasi: Erwinia sp D-glucosio Corynebacterium sp 2, 5 DKL 2 ketogulonico chimico ascorbato Unificazione del processo: • Co-immobilizzazione/co-coltivazione di Erwinia e Corynebacterium condizioni di massima velocità di conversione e/o crescita diverse rese basse

Unificazione del processo: • Erwinia ingegnerizzato con 2, 5 KDG reduttasi da Corynebacterium buone rese DH DH DH D-glucosio D-gluconico 2 keto gluconico 2, 5 DKG REDUTTASI Deidrogenasi periplasmatiche Reduttasi ricombinante citoplasmatica 2 KGulonico

ULTIMO PASSAGGIO 1 3 2 4 5 6 7

Ultimo passaggio VIA CHIMICA: due possibili processi VIA BIOCHIMICA?