Registro Toscano Difetti Congeniti VI Corso Residenziale Cortona

Registro Toscano Difetti Congeniti VI Corso Residenziale Cortona, 29 -30 nov. 2007 OSTEOGENESI IMPERFETTA Monica Mottes Dip. Materno Infantile e di Biologia e Genetica Università di Verona monica. mottes@univr. it 1

O. I. aspetti molecolari • Nella maggioranza dei casi (≤ 90%) è imputabile a mutazioni ad effetto dominante in uno dei due geni, COL 1 A 1 e COL 1 A 2, codificanti per il collagene I. • Molte sono le mutazioni “de novo” casi sporadici • Nella forma lieve (OI I) spesso casi familiari • Mosaicismo germinale in genitori sani può causare ricorrenza (5 -7%) • Mutation database (>>1000 mut): www. le. ac. uk/genetics/collagen/index. html 3

I geni del collagene I: 52 esoni di piccole dimensioni “standard” (45, 54, 99, 108 bp) 4

Motivo a tripla elica 5

OI: correlazioni genotipo-fenotipo difetto qualitativo OI tipo IV, III, II (p. es. sostituzione Gly mod, sev, letale in COL 1 A 1 O COL 1 A 2) difetto quantitativo (allele COL 1 A 1 silente) OI tipo I lieve 6

OI: correlazioni genotipo per sostituzioni di glicina COL 1 A 1 COL 1 A 2 NL L > mutazioni L in COL 1 A 1, effetto piu’ grave sost. G-Ser sono le piu’ frequenti in entrambi i geni e spesso NL P I (dati da : OI consortium, Hum Mutat 2007, 28: 209) 7

1. Ereditarietà dell’O. I. Autosomica dominante sporadica familiare ricorrente (mosaicismo germinale) 8

2. Ereditarietà dell’O. I. Autosomica recessiva (c. ca 5% dei casi di OI) • Recentemente (2006 -2007) identificati due nuovi loci malattia, causa di OI severa/letale con eredità AR 9

OI: correlazioni genotipo fenotipo • Qualche caso esemplare dalla nostra esperienza di diagnostica molecolare -G. Venturi, M. Corradi Sez. Pediatria DMIBG & Azienda Ospedaliera, Verona - M. Valli Dip. Biochimica, Pavia - JC Marini NIH Bethesda 10

OI : diagnostica molecolare • Sequenziamento diretto DNA genomico COL 1 A 1 e COL 1 A 2 esoni + splicing junctions • Quando disponibile biopsia: • anche analisi dei trascritti (p. es. per mutazioni di splicing) e analisi biochimica: valutazione delle catene collageniche • La ricerca della mutazione causale ha tempi lunghi • La DP è possibile solo per mutazioni già caratterizzate in famiglia 11

OI I-caso familiare Mottes et al. , J Med Genet 1990; 27: 367 1. Analisi di linkage con polimorfismi intragenici: locus concordante è COL 1 A 1 12

OI I-caso familiare 2. Analisi biochimica: catene collageniche hanno mobilità normale 3. Test “allele nullo: un allele COL 1 A 1 non produce m. RNA stabile g-DNA a 1(I) a 2(I) C P m. RNA 13

OI I –caso familiare • 4. Mutazione causale (in eterozigosi): Gene COL 1 A 1 Esone 41 g. 12698 C>T CAG (Gln) TAG (Stop) N. B. m. RNA contenenti codoni di terminazione prematura vanno incontro a degradazione Nonsense Mediated Decay (NMD) 14

OI severa (II/III)-caso sporadico ♀ deceduta all’età di 18 m per problemi respiratori * * medium cell layer Analisi biochimica: catene a 1(I) anomale * 15

OI severa (II/III)-caso sporadico • Mutazione: gene COL 1 A 1 esone 46 G>C (g. 13924 AF 017178) GGA(gly 910) GCA (ala) • La mutazione abolisce un sito Msp. I: Allele normale=279 bp Allele mutato= 315 bp N OI P 16

OI letale ricorrente 1. Analisi biochimica: migrazione anomala * catene a 1(I) minore secrezione procollagene I * 17

OI letale ricorrente 1: mosaicismo parentale • Mutazione: gene COL 1 A 1 esone G>A(g. 8867 AF 017178) GGC(gly 415) AGC(ser) (abolisce un sito Msp. I) * • presente in eterozigosi nel feto affetto, in quota variabile nel padre: 26 -29% spermatozoi ASO RFLP * 18

OI letale ricorrente 2 m c. l. * * Analisi biochimica: migrazione anomala * catene a 1(I) 19

OI letale ricorrente 2. • Sequenziamento completo (esoni + splicing junctions) dei geni COL 1 A 1 e COL 1 A 2 esito negativo 20

Nuovi loci malattia per OI: Morello et al. , Cell 127, 291 -304, 2006 Cabral et al. , Nature genet. 39, 359 -365, 2007 21

Biosintesi del collagene 22

Nuovi loci per OI LEPRE 1 (1 p 34) prolyl 3 -idrossilasi 1 CRTAP (3 p 22) cartilage associated protein Il complesso P 3 H 1+CRTAP+CYPB (ciclofilina B) è responsabile dell’idrossilazione del residuo a 1(I) Pro 986: assenza di idrossilazione= collagene anormale e grave deficit di mineralizzazione ossea Le mutazioni LEPRE 1 e CRTAP causa di OI sono del tipo “PERDITA DI FUNZIONE” 23

OI letale ricorrente 2. • Screening delle regioni codificanti di: • CRTAP (6 esoni + s. j. ) : negativo • LEPRE 1 (14 esoni + s. j. ) : positivo • Mutazione (in omozigosi): c. 1391 del. C frameshift nell’esone 9, produce PTC nell’esone 10. 24

OI letale ricorrente 2: eredità AR Rischio di ricorrenza per la coppia: 25% 25

CONCLUSIONI • I dati molecolari mostrano la notevole eterogeneità genetica dell’OI • Nella maggior parte dei casi (>90%) il difetto è a carico dei geni collagenici (COL 1 A 1/COL 1 A 2) • Screening negativo e trasmissione AR suggeriscono ricerca in altri loci (CRTAP e LEPRE 1) nelle forme gravi • Altri loci malattia potranno essere identificati in futuro 26

CLASSIFICAZIONE AGGIORNATA Sillence (>90%) Glorieux (<5%) Morello et al. , Cabral et al. (5%) TIPO OMIM# EREDITA’ GENE I lieve II letale 166200 AD COL 1 A 1 166210 AD COL 1 A 1, COL 1 A 2 III severo IV moderato VI mod/severo VIII letale 166210 AD COL 1 A 1, COL 1 A 2 166220 AD COL 1 A 1, COL 1 A 2 %610967 AD %610968 AD ? Collagene normale 610682 AR CRTAP 610915 AR LEPRE 1 27