Recapitulando Ac termina nuestro proceso productivo de la

Recapitulando… ¿Acá termina nuestro proceso productivo de la proteína recombinante?

Cromatografía como método de purificación

Purificación de proteínas recombinantes Cromatografía

Visión general de una cromatografía

Origen de la separación

Vocabulario de interés Fase móvil Fase estacionaria Analito Eluato Eluyente

Algunas definiciones • Eluyente: Disolvente utilizado para las muestras • Eluato: Analito que está siendo separado • Fase móvil: Es la fase que se mueve en una dirección definida. Suele ser líquida aunque las hay como gases • Fase estacionaria: es la sustancia que se encuentra fija durante la cromatografía. Puede ser una resina, un gel de sílice, etc. • Analito: Es la sustancia que va a ser separada durante la cromatografía

¿Porqué se desplazan los analitos? • Debido al fluir de la fase móvil (FM). ¿A qué velocidad migran los analitos? • Es el reflejo del tiempo que residen en la FM. • Velocidad máxima posible: es igual a la velocidad de FM (no existe retención). ¿De qué depende el tiempo de residencia en la FM? • COMPETENCIA entre la fase estacionaria y la fase móvil por cada analito. • Característico de cada analito en cada sistema cromatográfico velocidad de migración diferencial. • Interacciones posibles: dipolo-dipolo, puente de H, Vd. W, electrostáticas, hidrofóbicas.

Modo Cromatográfico La naturaleza de la fase estacionaria (modo cromatográfico) determina el tipo de interacciones que puede generar con los analitos a separar y, al mismo tiempo, la/s característica/s a tener en cuenta de la Fase Móvil IEX: Cromatografía de intercambio iónico HIC: Cromatografía de interacción por hidrofobicidad SEC: Cromatografía de exclusión molecular HPLC: Cromatografía líquida de alta presión FPLC: Cromatografía líquida rápida de proteínas

Ejemplo de equipo cromatográfico (FPLC)

Modos cromatográficos – Cromatografía de Exclusión Molecular Fundamento: Las moléculas de menor tamaño quedan retenidas mayor cantidad de tiempo en la fase estacionaria debido a la interacción mecánica con los poros en el polímero que forma la FE.

Métodos Adsortivos Adsorción Lavado Elución Intercambio Iónico (IEX) Interacción Hidrofóbica (HIC) Afinidad

Modos cromatográficos – Interacción hidrofóbica (HIC) Fase Estacionaria Posibilita interacción hidrofóbica con analitos C 8, C 18, Phenyl. Buffers acuosos con diferentes concentraciones de (NH 4)2 SO 4 Fase Móvil Fuerza de elución en directa relación con [(NH 4)2 SO 4 ]. ↑(NH 4)2 SO 4 eluye lo menos hidrofóbico. FM cambia durante el desarrollo cromatográfico Gradiente Precaución: no superar la [(NH 4)2 SO 4 ] que produzca el colapso de la FE o la precipitación de analitos dentro de la columna Criterio: Hidrofobicidad superficial Separación Adsorción Lavado Elución Orden de Elución: menor hidrofobicidad mayor hidrofobicidad Aplicación Mundo bioquímico-farmaceutico: purificación de proteinas/péptidos (TP: purificación de GFP)

Interacción hidrofóbica (HIC)-Desarrollo cromatográfico Adsorción Concentración elevada de (NH 4)2 SO 4 tal que se produce la adsorción de los analitos. Lavado Buffer concentración de (NH 4)2 SO 4 intermedia para producir la elución de lo analitos unidos de forma inespecífica a la columna. Elución Concentración de (NH 4)2 SO 4 tal que se produce la elución de los analitos secuencialmente, de menor a mayor hidrofobicidad. Conociendo la concentración de (NH 4)2 SO 4 a la cual eluye el analito de interés puedo mejorar la separación. 1. Buffer adsorción: concentración(NH 4)2 SO 4 suficiente para que el analito se adsorba, pero sea el de menor hidrofobicidad Lo menos hidrofóbico que el analito no se adsorbe en la columna (flow-through) 2. Buffer elución: concentración(NH 4)2 SO 4 ligeramente menor al BA ”solo” el analito de interés eluye lo más hidrofóbico que el analito no eluye.

Modos cromatográficos – Intercambio iónico (IEX) Fase Estacionaria Resina polimérica funcionalizada con grupos iónicos fijos o ionizables Intercambiador Fuerza Grupo funcional Carga Fija Carga Móvil p. H útil Cationico Fuerte Sulfonato (-SO 3 -) Negativa Todo Débil Carboxilato (COO- Fuerte Amonio 4°(-NR 3+) Débil Amonio 3°(-NHR 2+) Anionico Positiva >4 Positiva Negativa Todo <9

Modos cromatográficos – Intercambio iónico (IEX) Buffers acuosos con diferente p. H y fuerza iónica Fase Móvil Debe permitir /impedir interacción entre resina y analitos a separar. FM cambia durante el desarrollo cromatográfico Gradiente Fuerza iónica: impide interacciones electrostáticas Facil de ajustar p. H: ioniza/neutraliza la resina/analitos. Criterio: carga neta del analito. Separación Adsorción Lavado Elución Orden de elución: menor a mayor carga Aplicación Mundo bioquímico-farmaceutico: purificación de proteínas/peptidos, ácidos/bases débiles/fuertes.

Intercambio iónico (IEX)-Desarrollo cromatográficos Adsorción Buffer con p. H tal que tanto la resina como los analitos se encuentren cargados y baja fuerza iónica. Los analitos neutros o de igual carga que la resina no son retenidos (flow-through) Lavado Mismo buffer inicial (ligero incremento de FI), se busca eluir aquellos analitos que hayan sido retenidos de forma inespecífica Elución Buffer con mayor fuerza iónica, se produce la elución de los analitos retenidos, empezando por los de menor carga. Cambio de p. H como método de elución resulta caro y difícil.

Modos cromatográficos – Afinidad

Fase Estacionaria Fase Móvil Resina funcionalizada con ligandos que interactúan específicamente con el analito a separar. Diseñada a “medida” de “cada analito” Buffer unión: acuosos con fuerza iónica que permite unión ligandoanalito Buffer elución: acuosos con fuerza iónica elevada, ligando en exceso, molécula que compita por el ligando se produce la elución del analito retenido Criterio: afinidad ligando (FE) por analito/s Separación Adsorción Lavado Elución Mundo bioquímico-farmaceutico: purificación de proteínas/peptidos Aplicación Muy costosa y con poca amplitud de trabajo. Teóricamente: una fase estacionaria para cada analito a separar.

Cromatograma

Cromatograma – parámetros y análisis Ejes del gráfico Eje X Tiempo/Volumen Eje Y Señal del Detector Tiempo/volumen muerto (tm) Lo más rápido que puede salir un analito de la columna Tiempo/volumen retención (tr) Característico para cada analito en un sistema cromatográfica dado. Área del pico: proporcional a concentración Columna (flujo) ID