Reao de Polimerizao em Cadeia PCR 1 Introduo

Reação de Polimerização em Cadeia - PCR 1 -Introdução 2 -Automatização da PCR 3 -Sistema de reação 4 -Iniciadores – primers

A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma seqüência “alvo” de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas.

Introdução ü 1985 – Primeira Publicação - Science ü Cetus Corporation – R. Saiki; F. Faloona; G. Horn; K. Mullis; H. Erlichand; N. Arhneim. ü Descreveu a PCR: Fragmento específico de DNA multiplicado milhares de vezes – amplificação ü 1993 – Prêmio Nobel em Química Kary Mullis

Ciclos da PCR - Gráfico Etapa 1: DESNATURAÇÃO 94 -96˚C por 30’ 1˚ Ciclo Etapa 2: ANELAMENTO 50 - 65˚C por 1 min 2˚ Ciclo Etapa 3: POLIMERIZAÇÃO 72˚C por 1 min Número de ciclos numa reação: 30 a 35

ü Taq DNA Polimerase ü Bactéria termoestável Thermus aquaticus

Automatização da PCR Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas, controladas por computador Termociclador

Componentes da PCR Mg 2+ Taq Polimerase Tampão 10 x d. CTP d. NTP d. GTP d. ATP d. TTP H 20 Milli-Q Iniciadores: Forward/Reverse

4 -Iniciadores - primers • Tamanho – entre 10 a 30 bases • Composição de bases - ~50% de G/C • Seqüências – não devem ter complementaridades intra ou inter molecular • Cálculo da Tm

4 -Iniciadores - primers Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores • Do inglês: melting temperature • Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio entre a formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio • Para o cálculo: • Tm= 2(A+T) + 4(G+C)

APLICAÇÕES: v. Medicina forense; videntificação de patógenos (diagnóstico molecular); v. Genótipos (identificação de vírus, p. ex. )