Reaksi PCR Drs Sutarno MSc Ph D STRUKTUR

Reaksi PCR Drs. Sutarno, MSc. , Ph. D.

STRUKTUR DNA

PCR n n Thermocycler = mesin PCR = Mesin DNA PCR (polymerase chain reaction): teknik untuk mengamplifikasi (melipat gandakan) DNA secara invitro. PCR sangat spesifik, hanya fragmen DNA yang diinginkan yang diamplifikasi, dan sangat sensitif, tidak lagi memerlukan jumlah DNA dengan ukuran mikrogram, tetapi secara teori meskipun dari singel saja akan dapat diamplifikasi dengan PCR.

Kegunaan PCR n n Untuk skrining atau sekuensing secara cepat Sebagai pelacak peristiwa kriminal pada bagian forensik Diagnosa secara dini penyakit hepatitis B, TBC dll Mendeteksi bakteri patogen dalam air dan lingkungan (sensitivitas 110 sel/100 ml air).

Protokol reaksi PCR n n n n n Siapkan campuran reaksi yang terdiri dari: 200 ng DNA template, 0. 15 M dari masing-masing oligonukleotida primer, 200 M dari masing-masing d. NTPs, 2 m. M Mg. Cl 2, 10 x buffer dan 1, 5 unit Taq DNA polymerase dalam 0, 6 ml tabung effendorf dengan total volume 50 L Kontrol negatif (tanpa DNA template) selalu disertakan dalam semua reaksi melakukan 25 -35 siklus PCR

Siklus PCR n n Denaturasi : 94 o. C, 15 detik Primer annealing : 55 o. C, 30 detik Primer extension: 72 o. C, 1. 5 menit Akhiri siklus terakhir dengan perpanjangan pada 72 o. C selama 5 menit. Kemudian hentikan dengan mendinginkan pada suhu 4 o. C dan menambahkan 10 m. M EDTA (bila diperlukan).

Hal-hal penting yang perlu diperhatikan dalam reaksi PCR 1. Konsentrasi enzim n Taq DNA polimerase, konsentrasi: 1 -2. 5 unit per 5 L reaksi. Perlu optimisasi. Konsentrasi enzim terlalu tinggi background nonspesifik, terlalu rendah tidak cukup produk. 2. Konsentrasi d. NTPs n Konsentrasi masing-masing d. NTPs: 200 M hasil yang baik. Pengurangan konsentrasi d. NTPs dapat mengurangi mispriming pada tempat-tempat bukan target, dan mengurangi kemungkinan perluasan kesalahan penggabungan nukleotida.

3. Konsentrasi Magnesium n n Sangat penting untuk dioptimumkan konsentrasinya. Mg mempengaruhi: penguatan primer (primer annealing), suhu peruraian pada template, spesifikasi produk, formasi primer-dimer, dan aktifitas serta fidelitas enzim. Masing -masing reaksi PCR diperlukan 0. 52. 5 m. M melebihi konsentrasi d. NTP. EDTA dalam stok primer dapat mengganggu konsentrasi optimum mg.

4. Primer n n Umumnya antara 0. 1 -0. 5 M (+12 p. M lebih baik). Terlalu tinggi konsentrasi primer: terjadi kesalahan priming (mispriming) dan penumpukan hasil yg tidak spesifik serta menyebabkan munculnya primer-dimer (independent template), produk yg diinginkan menjadi rendah. Usahakan G-C content sekitar 50 -60%, melting temperatur antara 55 -80 o. C. Primer annealing: tergantung pada komposisi dasar, panjang dan konsentrasi primer, normalnya 5 o. C dibawah melting temperaturnya (hasil terbaik biasanya antara 55 -75 o. C). Peningkatan suhu annealing dapat menyedikirtkan kesalahan pemanjangan nukleotoda. Primer extension, tergantung pd panjang dan konsentrasi target sekuen serta temperatur; optimumnya 72 o. C.

5. DNA template n 200 ng DNA template, terlalu tinggi nonspesifik produk. 6. Waktu dan suhu denaturasi n Denaturasi DNA template yg tidak komplit kegagalan PCR. Umumnya 94 o. C selama 30 detik atau 97 o. C selama 15 detik cukup bagus. GC content tinggi, perlu suhu denaturasi sedikit lebih tinggi. 7. Jumlah siklus n tergantung konsentrasi permulaan DNA target bila parameter yg lain baik. Terlalu banyak siklus non-spesifik background; terlalu sedikit produk sedikit. Antara 25 -35 umumnya memberikan hasil yg baik.

Hasil Reaksi PCR setelah elektroforesis 6 5 4 3 2 100 bp 1 marker 600 bp 223 bp n 100 bp Figure 1. Photograph of an ethidium bromide stained agarose gel showing the specificity of the PCR products (223 bp) of locus 1 spanning intron IV and Exon V of the growth hormone gene, amplified using primers GH 1 and GH 2. Lane 1: Madura 1 (M 1), 2: (M 2), 3: Bali 1 (B 1), 4: (B 2), 5: Ongole derived 1 (PO 1), 6: PO 2.

Hasil PCR-RFLP setelah dilakukan elektroforesis 6 5 4 3 2 100 bp 1 marker 600 bp 223 bp n 100 bp Figure 1. Photograph of an ethidium bromide stained agarose gel showing the specificity of the PCR products (223 bp) of locus 1 spanning intron IV and Exon V of the growth hormone gene, amplified using primers GH 1 and GH 2. Lane 1: Madura 1 (M 1), 2: (M 2), 3: Bali 1 (B 1), 4: (B 2), 5: Ongole derived 1 (PO 1), 6: PO 2.

4 3 2 1 100 bp marker 600 bp 223 bp 171 bp 52 bp n 100 bp Figure 2. Gel photographs showing growth hormone gene polymorphisms detected by PCR-RFLP using Alu. I in locus 1 fragment. Lane 1 = LV, Lane 2 = VV, Lane 3 = LL, and lane 4 = Uncut.