RAMLSI CITOMETRIA FLOW CYTOMETRY FACS fluorescence activated cell

ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)] Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas laboratóriumi eljárás Az áramlási citometria és citométer működésének elve. A minta preparálása. A sejtpopuláció azonosítása méret és granuláltság szerint, scatter plot. Immunfenotipizálás, fluoreszcens jelölés, hisztogram, dot plot. Sejtfelszíni és sejten belüli antigének kimutatása. További alkalmazási területek: sorting, sejtciklus-analízis. Klinikai alkalmazási területek (példákkal): diagnózis, terápia és betegség progresszió monitorozása, prognózis. Gyakorló feladatok. PÁLLINGER ÉVA 1

A FLOW CYTOMETRIA ELŐNYEI FLOW CYTOMETRIA 105 -106 SEJT / VIZSGÁLAT 1 -2 MIN/ VIZSGÁLAT OBJEKTÍV (+/-) JÓ REPRODUKÁLHATÓSÁG AUTOMATIZÁLT MINTA ELŐKÉSZÍTÉS MIKROSZKÓPIA 102 -103 SEJT / VIZSGÁLAT 4 -5 MIN/ VIZSGÁLAT SZUBJEKTÍV (+/-) GYENGÉBB REPRODUKÁLHATÓSÁG IDŐIGÉNYESEBB MINTAELŐKÉSZÍTÉS 2

Mit mond el az áramlási citometria a sejtekről? • A relatív sejtméretet (Forward Scatter—FSC) • A sejtek relatív granuláltságát ill. belső komplexitását (Side Scatter—SSC) • A fluoreszcencia intenzitásukat 3

Hogyan működik az áramlási citométer? • Folyadék rendszer: Biztosítja a sejtek áramlását, a sejteket a gerjesztés helyére fókuszálja • Optikai rendszer: 1) fénygerjesztés: laser 2) az emittált fény eljuttatása a fotonsokszorozóhoz (PMT) • Elektronikus rendszer: a fényjelek digitális jellé alakítása 4

Folyadék rendszer laser sugár Flow cell (áramlási cella) Hidrodinamikus fókuszálás sheath flow (burok folyadék ) Minta áramlás Minta felvételi pont 5

Optikai rendszer A dikroikus filterek szelektíven engedik át a fényt. A fénysugár irányításában és a PMT-be jutó fény „kiválasztásában” van szerepük. 6

BD Facs Calibur 7

Milyen kérdéseket tehetünk fel egy áramlási citométernek? 1. 2. 3. 4. 5. 6. Azonosíthatók a sejtpopulációk a vizsgálati mintában? (heterogenitás) Meghatározható a sejtek aktiváltsági, differenciáltsági és érési stádiuma? Jellemezhetjük a sejtek funkcionális állapotát? Meghatározhatjuk a sejtek abszolút számát a mintában? Detektálhatjuk quantitatív módon különféle szolubilis fehérjék jelenlétét a mintában? Fizikailag elválaszthatjuk (szeparálhatjuk) a sejteket egymástól? Válasz: IGEN 8

Milyen paramétereket használhatunk a kérdéseink megválaszolására? • Relatív méret és granuláltság (FSC/SSC) • Fluoreszcens jelek a sejtfelszínről és/vagy a citoplazmából • Fluoreszcens jelek időbeni detektálása 9

MEGFIGYELÉSI MÓDOK Sejtszuszpenzió!!! 1. 2. 3. FESTETLEN VIZSGÁLATI MINTÁK ANALÍZISE (sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint) FESTÉS FLUROKRÓMMAL JELZETT MONOKLONÁLIS ANTITESTEKKEL = IMMUNFENOTIPIZÁLÁS (sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján) SEJTALKOTÓRÉSZEKHEZ SPECIFIKUSAN KÖTŐDŐ FESTÉKEK ALKALMAZÁSA 10

Mintaelőkészítés • Sejtszuszpenzió készítés • Alvadt vérből (alvadékos vérből) nem lehet mérést végezni! • Erythrolysis • Festés (ha szükséges) • Sejtalkotórészek közvetlen jelölése • Immunfenotipizálás 11

Minőség ellenőrzés • Technikai • A készülék beállításának és állapotának ellenőrzése (napi és időszakos) • Fluoreszcencia kompenzáció • Biológiai • A mintaelőkészítés ellenőrzése (pozitív és negatív kontrollok használata) • Izotípus ellenanyag jelölés • Autofluoreszcencia detektálás 12

Fényszórási jellegzetességek Right Angle Light Detector (Side scatter parameter = SS) Granuláltság Light Source (LASER) Forward Light Detector (Forward scatter parameter == FS) Sejtméret 13

Sejtmegoszlás méret és struktúráltság szerint granuláltság Eosinophil granulocyta Neutrophil granulocyta Monocyta Lymphocyta Basophil granulocyta méret 14

Sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint egészséges csontvelő Milyen eltérést lát a képen, mi okozhatja? 15

Mi is az a fluoreszcencia? A fluorochrom energiát vesz fel a laser fényből (gerjesztődés) = 488 nm O HO = 520 nm C Fényenergia kibocsátott fluorescens fény CO 2 H Fluorescens Molecula Antitest A fluorochromok kibocsájtják a felvett energiát: A kibocsátott fény hullámhossza nagyobb, 16 mint a gerjesztő fényé

Emissziós spektrum 100% FITC Normalized Intensity Fluorescein isothiocyanate APC RPE R-Phycoerythrin Per. CP peridinin chlorophyll A protein Allophycocyanin 0% 400 500 600 Wavelength (nm) 700 800 A kibocsátott fény hullámhossza függ: 1) a fluorokróm típusától, 2) a fluorokróm környezetétől 17

Fluoreszcencia Az emittált fluoreszcencia intenzitás arányos a gerjesztett festék molekulák számával FITC FITC FITC Sejtszám FITC Fluoreszcencia intenzitás (log) 18

A fluoreszcens jelek grafikus megjelenítése Hisztogram Felhő kép (Dot plot) 19

SEJTTÍPUSOK Cluster of Differentiation = CD (Differenciálódási markerek) 1. Leukocyta szubpopulációk azonosítása 2. Leukocyták érési / funkcionális állapotának meghatározása „Az immunológia alapjai” TK Függelék 1. táblázat 20

Differenciálódási markerek FELHASZNÁLÁSA AZ IMMUNRENDSZER SEJTJEINEK VIZSGÁLATÁBAN: IMMUNFENOTIPIZÁLÁS MÓDSZEREK: ÁRAMLÁSI CITOMETRIA IMMUNHISZTOKÉMIA 21

Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján IMMUNFENOTIPIZÁLÁS Megválaszolható (biológiai) kérdések: • Expresszió: IGEN (+) vagy NEM (-) • A „pozitív” és a „negatív” populációk %-os megoszlása • A sejtek relatív fehérje expressziója • Koexpresszió 22

Lymphocyta alcsoportok Funkcionális és morfológiai (immunfenotípus) kategóriák CD 3 CD 56+ Ly CD 3+ CD 56+ NK CD 3+ NKT CD 19+ T gd. T Tc CD 3+ gd. TCR+ CD 4 CD 8 - CD 3+ CD 8+ B CD 3+ CD 4+ Th B 1 CD 5+ B 2 Plazmasejt ic könnyűlánc+ Treg Th 1 Th 2 Th 17 CD 4+ CD 25 high+ Foxp 3+ IFNg+ IL-12+ TNFa, b+ IL 4+ IL-5+ IL-10+ IL-13+ IL-17+ TGFb+ 23

„Igen-nem” válasz 1. Jelen van-e a vizsgálati mintában a keresett sejttípus? 2. Mekkora arányban van jelen? 3. Mekkora az abszolút mennyisége? 24

Sejtfelszíni antigén expresszió mértéke lymphocyta CD 4 high+ CD 4 dim+ monocyta Azonos mértékben expresszálják-e a vizsgálati minta sejtjei a keresett fehérjét? Mire lehet következtetni az expressziós eltérésekből? 25

IMMUNFENOTIPIZÁLÁS CD 3 -/CD 8+ CD 3+/CD 8+ CD 3 -/CD 8 - CD 3+/CD 8 - Milyen sejttípusba tartozhatnak a kettős negatívan festődő sejtek? 26

KLINIKAI PÉLDA AZ IMMUNFENOTIPIZÁLÁSRA 27

Myeloma multiplex: a plazmasejtek daganatos megbetegedése Eset leírás: 36 éves férfi minimális traumát követően felkar törést szenvedett. Gyakran fáj a háta, időnként lázas is. Testsúly mérsékelten csökkent az utóbbi időben, változatlan táplálkozási szokások mellett. Fizikális vizsgálat: a láz és a hátfájdalom eredetére utaló jel nem észlelhető. RTG vizsgálat: diffúz osteoporosis a gerinc háti szakaszán Laboratóriumi vizsgálatok: anaemia, hypercalcemia, monoklonális paraprotein. Iránydiagnózis: Myeloma multiplex Javasolt a csontvelő vizsgálata: kenet, FACS csontvelő 28

CD 34+ ckit (CD 117) + HLA-DR+ Td. T+ lymphoid progenitor B SEJTVONAL DIFFERENCIÁLÓDÁSI ANTIGÉNEK Pro B Pre B CD 34+ CD 19+ CD 10+/ic CD 22+ HLA-DR+ Td. T+ CD 34+/CD 19+ CD 20+ CD 10+ ic CD 22+ ic m + HLA-DR+ Td. T+ csontvelő antigén-független Éretlen B CD 19+ CD 20+ CD 21+ CD 22+ s. Ig. M+ CD 34 CD 10 HLA-DR+ Td. T+ Érett B CD 19+ CD 20+ CD 21+ CD 22+ s. Ig. M+/s. Ig. D+ HLA-DR+ Fc. R+ CD 11 b+ Aktivált B Plazmasejt CD 19+ CD 20+ CD 21+ CD 22+ s. Ig+ HLA-DR+ Fc. R+ CD 11 b+ periféria antigén-függő CD 19 CD 45 CD 38+ s. Igic k+ v. ic + HLA-DR+ 29

A Myeloma multiplex diagnosztikája FACS módszerrel KONSZENZUS PROTOKOLL CD 45/CD 14 CD 45/CD 38/HLA-DR CD 45/CD 138 CD 10/CD 5/CD 19 CD 34/CD 33/CD 19 CD 22/CD 20 Kappa/Lambda/CD 19 intracelluláris kappa/lambda CD 4/CD 8/CD 3 30

CD 45/CD 38 jelölés Csontvelő (FACS) CD 38 pozitív CD 45 negatív Nagy méretű sejtek 31

CD 45/CD 138 jelölés CD 45 negatív Nagy méretű sejtek CD 138 pozitív 32

Sejtfelszíni k/l/CD 19 jelölés 33

Citoplazmatikus k/l jelölés Nagy méretű sejtek Citoplazmában sok l Immunfenotípus: CD 45 -/CD 19 -/CD 38+/CD 138+/iclambda+: plazmasejt 34

Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásával KLINIKAI PÉLDA CD 4+/CD 25+ AKTIVÁLT Th SEJTEK CD 4+/CD 25 high+ REGULATÓRIKUS T SEJTEK 35

A sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásának klinikai jelentősége 1. vérvétel 2. vérvétel A monociták HLA-DR expressziójának csökkenése rossz prognózist jelent szeptikus állapotokban. Izotípus kontroll 1. vérvétel 2. vérvétel 36

Technikai vonatkozások Kalibrációs görbe M 1 * y = 1, 0076 x – 1, 6642 r 2 = 0, 999 37

Immunfenotipizált sejtek további vizsgálati lehetőségei: sejtszeparálás („sorting”) 38

Mechanikus szortolás „WASTE” SZEPARÁLT SEJTEK ÁRAMLÁSI CELLA MINTA 39

Elektrosztatikus szortolás ELEKTROMOS TÖLTÉS KONDENZÁTOR ÁRAMLÁSI CELLA SZEPARÁLT SEJTEK 1 SZEPARÁLT SEJTEK 2 „WASTE” MINTA 40

Sejtpopulációk jellemzése sejtszeparálás után KUTATÁSI PÉLDA Csontvelő CD 34+ sejtek HDC expresszió RNS izolálás 41

Sejtalkotórészekhez specifikusan kötődő festékek alkalmazása 42

SEJTCIKLUS ANALÍZIS: PI festés „S” fázis emelkedés malignus sejtekben Propidium jodid (PI) a kétszálú DNS-hez és RNS-hez sztöchiometrikusan kötődő fluorokróm. Alkalmazásával lehetőség nyílik a nekrotikus, az apoptotikus és az ép sejtek elkülönítésére. Klinikai jelentőség: malignus sejtek osztódási képességének 43 jellemzése

A flow cytometria klinikai alkalmazása 44

Klinikai megközelítés • • Diagnózis Terápia monitorozás Prognózis Pathológiás állapotok aktivitásának nyomonkövetése 45

Rutin vizsgálatok célja • • • Sejtarányok és abszolút sejtszámok meghatározása Pathológiás sejtek kvalitatív és kvantitatív analízise Aktivációs markerek kimutatása Sejtciklus vizsgálatok Sejtek funkcionális jellemzése 46

A flow cytometria helye a rutin klinikai gyakorlatban • • • HEMATOLÓGIAI KÓRKÉPEK IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK Autoimmun betegségek HLA-asszociált betegségek Fertőzések 47

A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN 48

A malignus haematológiai betegségek diagnosztikája Klinikai tünetek Morfológia Quantitativ és qualitativ vérkép Csontvelő kenet ill. biopszia Cytokémia Flow cytometria, immunhisztokémia Cytogenetika, molekuláris genetika 49

A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN • DIAGNÓZIS / DIFFERENCIÁL DG. • MARADÉK LEUKAEMIA (minimal residual disease) • BETEGSÉG KIÚJULÁS (recidiva) • CHEMOTHERÁPIA MONITOROZÁS • MULTIDRUG REZISZTENCIA 50

DIAGNOSZTIKUS SÉMA A LEUKÉMIÁK VISGÁLATÁHOZ AKUT LEUKÉMIA AML, AMML ALL non. T-ALL CALLA+ T-ALL CALLA- CALLA = common acute lymphoid leukemia antigen = CD 10 A legfontosabb prognosztikus marker az ALL diagnosztikájában 51

MULTIDRUG REZISZTENCIA MDR fehérje vizsgálata FACS módszerrel Pgp kimutatás (immunfenotipizálás) Pgp funkcionális jellemzés (pl. Calcein) 52

FL FL FL Aktív pumpa funkció FL FL FL sejtszám Fluorokrómmal feltöltött sejt FL FL 53

IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK • CONGENITÁLIS (PRIMER) • ŐSSEJT DEFEKTUSOK • A TERMÉSZETES IMMUNRENDSZER MŰKÖDÉSI ZAVARAI • A HUMORÁLIS IMMUNVÁLASZ ZAVARAI • A CELLULÁRIS IMMUNVÁLASZ ZAVARAI • SZERZETT (SZEKUNDER) • pl. HIV fertőzés 54

NORMÁL SEJTARÁNYOK VÁLTOZÁSÁNAK DETEKTÁLÁSA IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOKBAN lymphocyta szubpopulációk vizsgálata: CD 45/CD 14 (quality control: ly kapu tisztasága) CD 3/CD 19 (T / B arány) CD 3/CD 56 (T / NK arány) CD 8/CD 4/CD 3 (Tc / Th arány) CD 4/CD 3/CD 45 RO (Memória T) CD 4/CD 3/CD 45 RA (Naiv T) CD 4/CD 8/CD 25 (aktivált T, ill. Treg) TCR g/d CD 5/CD 19 (B 1 B, össz B) s. Ig. M/s. Ig. D/CD 19 (naiv B) k/ /CD 19 (B sejt klonalitás) 55

VIZSGÁLATOK AIDS-BEN CD 3+/CD 4+ Th SEJTEK QUANTITATÍV MEGHATÁROZÁSA PROGNÓZIS IMMUNSTÁTUSZ MONITOROZÁS 56

A flow cytometria helye az autoimmun betegségek diagnosztikájában • Nem diagnosztikus értékű • Jó prognosztikus paraméterek • A betegség aktivitásának nyomonkövetése 57

HLA-ASSZOCIÁLT BETEGSÉGEK • • Diagnózis alátámasztása Prognosztikus jelentőség Kockázati tényező Leggyakoribb klinikai alkalmazás • HLA-B 27 expresszió vizsgálata perifériás leukocitákon (Bechterew) 58

A FLOW CYTOMETRIA HELYE A FERTŐZÉSES ÁLLAPOTOKBAN Az immunrendszer válaszkészségének monitorozása • VÍRUS FERTŐZÉSEK: • CD 4/CD 8 ARÁNY CSÖKKEN • BAKTERIÁLIS FERTŐZÉSEK : • ABSZOLÚT CD 4+ és CD 8+ T SEJT SZÁM CSÖKKENÉS • SZEPSZIS • CD 14 DIM/CD 16 HIGH/HLA-DR+/CD 4+/CR 1+ MONOCYTA SZUBPOPULÁCIÓ NŐ • CD 14+/HLA-DR+ MONOCYTA CSÖKKEN • T SEJT AKTIVÁCIÓ NYOMONKÖVETÉSE • T SEJT APOPTÓZIS MEGHATÁROZÁSA 59

FUNKCIONÁLIS TESZTEK 60

Sejtfunkciók vizsgálata autoimmun betegségekben A BETEGSÉG AKTIVITÁSÁNAK NYOMONKÖVETÉSE 1. Th 1/Th 2 sejtarány kimutatása az intracelluláris citokinek detektálásával 2. Szolubilis citokinek kimutatása testnedvekben (mikrogyöngy módszer) 61

Intracelluláris citokin kimutatás Milyen sejtpopulációk láthatók az ábrák bal felső részén? 62

Y* Szolubilis citokin kimutatás Y Y * Y * * * Y mikrogyöngy Y Citokint felismerő ellenanyag 1. * Y* Y Fluorokrómmal jelzett citokint felismerő ellenanyag 2. Citokin Melyik korábban tanult módszerhez hasonlít? 63 Y

Sejtfunkciók vizsgálata immunhiányos állapotokban • FAGOCITA KÉPESSÉG VIZSGÁLATA (FLUOROCHROMMAL JELZETT PARTIKULUMOK FELVÉTELE) • ROI TERMELÉS VIZSGÁLATA 64

Fagocita képesség vizsgálata 65

ÖSSZEFOGLALÁS 66

A FLOW CYTOMETRIA ABSZOLÚT INDIKÁCIÓS TERÜLETEI • Malignus hematológiai betegségek diagnosztikája és differenciáldiagnosztikája • Minimális reziduális betegség kimutatása • Multidrug rezisztencia vizsgálata • Csontvelő transzplantáció nyomonkövetése • AIDS 67

A FLOW CYTOMETRIA RELATÍV INDIKÁCIÓS TERÜLETEI • Autoimmun betegségek aktivitásának nyomonkövetése • HLA-asszociáció kimutatása • Fertőzések nyomonkövetése • Sejtciklus analízis • Sejtfunkciók detektálása • Receptro expresszió kimutatás 68

Irodalom: • Fülöp A. K. (Szerk. ): Immunológiai szemináriumok, 5. fejezet. • Falus A, Buzás E. , Rajnavölgyi É. (Szerk. ): Az immunológia alapjai, 14. 5 -6. fejezet Következő hétre: Immunszerológia • Fülöp A. K. (Szerk. ): Immunológiai szemináriumok, 3. fejezet. 69

Fakultaív gyakorlás Milyen sejtek szaporodtak fel a vizsgálati mintában? Mi a diagnózis? 70

1. PRE-PRO B SEJTEK: CD 34+/CD 10+/CD 19+ 71

2. 1. Homogén lyblaszt populáció 2. Granulocyta kevés 3. CD 45 dim+/HL A-DR+ 72

2. CD 34+/CD 33+ 73

2. CD 7+/CD 13+ CD 45 dim+/HLA-DR+/ CD 34+/CD 33+/CD 7+ AML 74

3. 1. Ly populáció 2. Sok HLA-DR+ ly 75

3. Ly kapun belül sok CD 19+/CD 5+ B 1 B sejt 76

3. A CD 19+ B sejtek lambda könnyűláncot expresszálnak (klonális felszaporodás) 77

3. CD 45+/CD 19+/CD 5+/sejtfelszíni lambda+/HLA-DR+ B-CLL 78

Animált tutorial • http: //probes. invitrogen. com/resources/educ ation/tutorials/4 Intro_Flow/player. html 79