RAKENDUSBIOLOOGIA Koostas Kersti Veskimets Fundamentaalteadused ja rakendusteadused l
RAKENDUSBIOLOOGIA Koostas Kersti Veskimets
Fundamentaalteadused ja rakendusteadused l l l Fundamentaalteadused püüavad välja selgitada loodusseadusi. Rakendusteadused otsivad avastatud loodusseadustele kasutamisvõimalusi. Tooge näiteid, kus sellest kasu saab?
Bioloogias on samuti… l l fundamentaalteadused … ja rakendusteadused… BIOTEHNOLOOGIA – rakendusbioloogia valdkond, kus kasutatakse organisme, et toota inimesele vajalikke aineid. Peamiselt bakterid, seened, GM- loomad ja – taimed.
Biotehnoloogia eelised: Säästab energiat l Vähem ja kahjutud jäätmed l Odav tooraine ja puudused: Ajakulu vastavate organismide leidmiseks, kasvatamiseks. Tundlikkus keskkonnategurite suhtes. l
Noored “biotehnoloogid” Tallinna Tehnikaülikooli Loodusteadustemaja õppelaboris
Mida toodetakse biotehnoloogiliselt? Toiduainetetööstuses juba sajandeid: juust, kohupiim, jogurt jt. piimatooted.
köögiviljade hapendamine (kurk, kapsas, seened). pärmitaigen – leib, sai, jne.
Õlle ja veini tootmisel
Toidu omaduste parandamiseks Seentest saadud ensüümid (proteaasid) kalgendavad piima juustu tootmisel, parandavad leiva ja õlle omadusi. Pintselhalliku abil toodetakse hallitusjuustu ja salaamit.
Bakterite ja hallitusseente amülaasi kasut. siirupi tootmisel (tärklisest sahharoosi).
Funktsionaalne toit … toidule on lisatud midagi, et see parandaks inimese tervist. Biokeefir, biojogurt – lisatud probiootilisi baktereid, mis parandavad seedimist, immuunsüsteemi. “Hellus” sisaldab Eestis patenteeritud Lactobacillus fermentum ME-3, mis hävitab düsenteeria, salmonelloosi ja ateroskleroosi…
Ka meditsiin kasutab biotehnoloogiat juba terve sajandi • Antibiootikumid seentest ja bakteritest (penitsilliin ja etratsükliin) A. Fleming avastas penitsilliini 1929. a • Alkaloidid, mida kasutatakse Parkinsoni tõve ja migreeni raviks.
Põllumajanduses • Silo valmistamisel • Mügarbakterid küntakse mulda. • Biotõrje (taimekaitsevahendid) – - seentest saadud ensüümid peletavad putukaid ja seenhaigusi. - feromoonidega meelitatakse kahjurid lõksu - bakteritoksiin (Bt-toksiin on parim) tapab putukaid selektiivselt ja inimesele mõju ei avalda.
Silotorn
• http: //www. oldergrupp. ee/index. php/page, Valgeristik. RETOR
Biogaas?
Tööstuses Bioplast – laguneb looduses kiiremini. Biogaas – prügimägede lagundamine bakterite abil Bakterid lagundavad prügimäed alkoholiks. B. toodavad ämblikuniiti – ülitugev materjal Bakterid toodavad puuvilla. Bakterid puhastavad maaki. Bakterid puhastavad reovett (aktiivmuda).
Pesuvahendites Ensüümid saadakse bakteritest ja seentest. Intelligentsed pesupulbrid lagundavad lipiide, valke, polüsahhariide jne.
RAKU- JA EMBRÜOTEHNOLOOGIA Kloonimine on geneetiliselt identsete järglaste saamine, Ka vegetatiivne paljunemine on kloonimine. Meristeempaljundus on uuem meetod: Meristeemrakud on diferentseerumata ja paljunemisvõimelised. Nad on totipotentsed – “kõikvõimelised”.
Kasvukuhikust võetakse mõned rakud, pannakse söötmesse (steriilselt). Ühest meristeemist võib saada sadu võrseid. Saadakse viirusvabasid taimi: kartul, maasikas, nelk, krüsanteem. http: //oregonstate. edu/potatoes/CSS 322 Web. Notes. html
Hübridoomitehnoloogia ja monoklonaalsed antikehad • Teatud antigeen viiakse hiiresse. • Hiires tekivad vastavaid antikehi tootvad B -lümfotsüüdid. • B-lümfotsüüdid viiakse kokku kasvajarakkudega – need on hübridoomid. • Selektiivsöötmel jäävad ellu ja paljunevad ainult hübridoomid. • Nüüd on puhaskultuur ühte tüüpi antikehi tootvatest, hästi paljunevatest rakkudest.
Antigeen Monoklonaalsete antikehade tootmine Rakud ühendatakse Antikehasid tootvad B-lümfotsüüdid Kasvajarakud paljunevad hästi Monoklonaalsed antikehad http: //www 3. niaid. nih. gov/ topics/immune. System/frontier Images. htm
Monoklonaalseid antikehi kasutatakse: 1. Antigeenide määramiseks 2. Teatud valkude puhtaks eraldamiseks 3. Haiguste avastamiseks 4. Rasedustestis. Testjoon värvub ainult siis, kui proov sisaldab kooriongonadotropiini. http: //thejenniferblog. files. wordpress. com/2008/01/pregnancy_test. jpg
Embrüosiirdamine ja viljastamine in vitro Superovulatsioonil küpseb lehmal palju munarakke. Pärast seemendamist pestakse embrüod välja. Nende hulgast valitakse parimad ja viiakse surrogaatemasse. Katseklaasi (in vitro) viljastamise meetod 1970 a Miks tehakse? Heade omadustega loomalt saab palju järglasi. Embrüod säilivad sügavkülmutatult, saab transportida.
Embrüosiirdamine inimesel Esimene laps sündis Inglismaal 1978. a. , Eestis 1993. a. Nüüd on neid üle 2 miljoni. Lastetuid abielupaare on Eestis 10 – 20%. Asendusema ei ole Eestis lubatud. In vitro viibib embrüo ainult 2 -5 päeva. Munarakud võetakse otse munasarjast nõelpipetiga.
Imetajate kloonimine Embrüonaalkloonimine: Varase embrüo rakud on totipotentsed, need eraldatakse ja viiakse mitmetesse emasloomadesse. Igast rakust saab areneda tervikorganism. Kõik nad on geneetiliselt omavahel samad. Tuumkloonimine
Tuumkloonimine s. t. keharaku tuuma viimisel munarakku on saadud uus organism. 1997. a. saadi esimene tuumkloonitud lammas Dolly. Katse näitas, et imetajate tuumas on kogu organismi arenguks vajalik aktiivne geneetiline info olemas. Kas Dollyl on ainult tuumadoonori geenid?
Udararakust võeti tuum Rakud liideti elektriimpulsiga Munaraku tuum eemaldati Rakk jagunes nagu embrüo Embrüo siirdati Sündis kloon – kolmandale lambale Dolly http: //www. millerandlevine. com/cloning/dolly-fig-13 -13. jpg
Kloonitud on hiiri, küülikuid, kasse, lambaid, kitsi, sigu, muulasid, veiseid, hobuseid jne. Pole suudetud kloonida ahve, konni. Tegelikult enamus katsetustest ei õnnestu: nt. hobune saadi 328 katsetuse tulemusel. Kloonide eluiga on normaalsest lühem. Miks? Tegelikult ei ole kloonid väljanägemiselt ja omadustelt identsed. Ka ühemunakaksikute sõrmejäljed on erinevad.
Miks kloonida? : 1. Transgeensete organismide saamiseks 2. Mudelhiired luuakse, et leida ravimeid inimese haigustele. 3. Hävimisohus olevate liikide säilitamiseks: võetakse hävimisohus looma tüvirakust tuum ja viiakse see lähedase liigi munarakku. Munarakk siirdatakse tagasi looma emakasse. Sünnib hävimisohus liigi esindaja.
Inimese kloonimine? Miks ebaeetiline? Põhjenda, kas Georg Otsa, Lennart Meri, Arvo Pärdi kloonid oleksid samade omadustega? Reproduktiivsel kloonimisel saadakse tervikorganism. Terapeutilisel kloonimisel tehakse embrüo in vitro ja kasutatakse selle rakke raviotstarbel. Selline kloonimine legaliseeriti Suurbritannias 2001. a.
Tüvirakud ja rakuteraapia Selgroogsete tüvirakud on diferentseerumata või vähediferentseerunud rakud. Rakuteraapia – tüvirakke kasutatakse kahjustunud kudede taastamisel. Parimad on sügoodi esimestel jagunemistel tekkinud rakud – totipotentsed. Embrüoplasti rakud võivad ainete toimel areneda igaks koeks. Nabaväädi tüvirakud saavad ka erinevateks kudedeks. (säilitatakse sügavkülmas)
Täiskasvanu tüvirakud: Ammu on tuntud vereloometüvirakud. Viimased uurimused näitavad, et kõikides kudedes on omad tüvirakud, ka närvikoes. Mida aktiivsem inimene, seda enam neuronid paljunevad! Pealegi saab juba ükskõik millise keharaku suunata teatud ainetega arenema ükskõik mis suunas. Sea rakkudega saab ka inimesi ravida!
Töötatakse inimese südameklappide, rindade, kõrvade, luude, kõhrede jt. kehaosade kunstliku kasvatamise kallal. Katseklaasi-põis hakkas inimeses tööle.
GEENITEHNOLOOGIA …on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO. Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks. Esimene transgeenne bakter tehti 1973. a. Nokautorganism – organism, kellel teatud geen on maha surutud.
Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA.
Vektor Restriktaas Lõigatud DNA Restrikataas (sama) Lõigatud vektor Kleepuvad otsad ühinevad Rekombinantne plasmiid
Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nimetame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga
Viirusvektor viib soovitud geeni rakku
Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. Nii saab üle viidud geeni avaldumist organismis kindlaks teha: vaatad ja näed, et helendub!
Fluorestseeruv valk – GFP on saadud meduusist. O. Shimura eraldas esimesena Nobeli preemia 2008
Plasmiid, mis sisaldab GFP-geeni ja antibiootikumiresistentsust määravat geeni
Inimese kasvajat põhjustavale geenile on lisatud GFP- geen. See on viidud hiire rakkudesse ning nüüd on võimalik jälgida kasvaja arengut, siirdeid jne.
Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad m. RNA , mille alusel sünteesitakse valk. Kui tahame bakterisse geeni viia, siis peame selle m. RNA alusel tegema DNA - õnneks on avastatud pöördtranskriptaas, mis selle töö ära teeb. Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen inimese rakuski teeb.
RNA transkript http: //faculty. ircc. edu/faculty/tfischer/images/introns-exons. jpg
Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast Esimene oli insuliin. Inimese kasvuhormoon Erütropoietiin aneemia raviks Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi Vere hüübimisfaktorid Difteeria ja teetanuse vaktsiin Pärmseened teevad B-hepatiidi vaktsiini Putukarakud toodavad papilloomi vaktsiini
Transgeensed loomad Esimene transgeenne hiir saadi 1981. a. : roti kasvuhormooniga kasvas 2 X suuremaks. Miks hiiri kasutatakse kõige rohkem? Transgeensete suurimetajate saamine on keerukas: munarakk kahjustub, embrüosiirdamine ei ole sageli edukas jne. Tartus plaanitakse luua lehm, kes toodab insuliini (Sulev Kõks ja Ülle Jaakmaa).
Näited ravimeid tootvatest loomadest • GM-kitse piimas antikehad kasvajate vastu • GM-lehma piimas laktoalbumiin enneaegsetele lastele • GM-sead toodavad inimese hemoglobiin
Geenitehnoloogia loomade tõuaretuses • Sigade ja lammaste kaal kasvas 30% • Kalkunite munevus suurenes • Lihaloomad, kelle tailiha ja rasva osakaal on täpselt määratud • Forell jt kalad kasvasid 2 korda suuremaks
Transgeensed taimed Et saavutada: - putukaresistentsus - Bt-toksiini määrav geen on viidud taimesse ja mürke polegi vaja (tomat, mais, puuvill, kartul), - viirusresistentsus, (papaia) - herbitsiidiresistentsus (peet, mais, puuvill, lina, raps, soja, riis) - suurem saagikus, - lamandumis- ja külmakindlus, - viljade pikem säilivusaeg
- paremad maitseomadused, - suurem toiteväärtus: A-vitamiiniga kuldne riis
Tomat, banaan, mango, papaia: pikema säilivusajaga Hawail harilike papaia sortide kasvatamine keelati, sest need levitasid viiruseid. Kõik on GM-papaiad. .
GM-taimede kasvatamise levik USA-s 2005. a. seisuga: • • • Soja 89% Mais 61% (maisi saagikus on tõusnud 30%) Puuvill 83% Riis Raps Suurimad kasvatajad: USA, Argentiina, Kanada, Hiina.
Sordiaretuse ajaloost? • 10 000. a. tagasi põllumajanduse algus – valiti juhuslikult. • 19. saj. selektiivne ristamine • 20. saj. algus mutagenees ja selektsioon • 1987. a. esimesed GM-taimed • 1990 -ndad GM-taimede levik USA-s, Aasias jm. • 1998. a. EL keelustas kõik GMO-d. • Nüüd on Euroopas lubatud, kui taotled loa. (ülikeeruline, meeletu paberi, aja ja raha raiskamine)
GMO-aretuse poolt: • • Kiiremad tulemused Geenid teistelt liikidelt Geenide avaldumist saab reguleerida Teatakse täpselt, millist geeni üle kantakse, mis muutub uues sordis. • Põldudel kasutatakse vähem keskkonnamürke. See on täppissordiaretus.
GMO-aretuse vastu: • Kahjurid võivad muutuda immuunseks. • Geenid võivad üle kanduda umbrohule. • Erinevate organismide geenide koostoime võib olla ettearvamatu. • GM-taimede maitseomadused on tavaliselt halvemad.
Geeninokaut Geen lülitatakse välja. On loodud sadade geenide suhtes “nokauti löödud” hiiri. Tehnika on keeruline: 1. Geenivektor (vigane geen+marker) viiakse hiire embrüonaalsetesse tüvirakkudesse. 2. Vektor satub ristsiirdega genoomi. 3. Selektiivsöötmel jäävad ellu mutantsed rakud, need on nokautrakud.
4. Nokautrakud siiratakse uude embrüoblasti 5. Tekib kimäärne embrüo 6. See embrüo viiakse hiire emakasse 7. Sünnivad kimäärsed hiired (neid hoitakse) 8. Järgneva ristamise tulemusena sünnib ka homosügootseid nokauthiiri.
• Mudelhiired – haiguste uurimiseks. • Organite kasvatamiseks GM-loomade baasil. .
Geeniteraapia Inimesel on teada üle 3000 päriliku puude. Kaks võimalust: 1. Asendada haige geen tervega 2. Vaigistada haige geen. Neid tegevusi ei tehta munarakuga, need ei pärandu järglastele. On kohati häid tulemusi, kuid enamasti mitte.
Immuunpuudulikkuse ravi oli 1990. a. suhteliselt edukas Parkinsonitõve ravi ajutiselt. Geenivaigistamiseks kasutatakse mikro. RNA molekule. Kui mi-RNA-d ühinevad m. RNAga, siis viimane lagundadakse. Nii saaks ravida Huntingtoni haigust. Geenivaigistamine on täiesti uus suund!
Muid geenitehnoloogia rakendusi 1. Molekulaargeneetiline diagnostika Enamasti põhineb mutantsete geenide äratundmisel. DNA-kiibid - võrdlus DNA-lõigud, millega patsiendi geene kõrvutada – saab tuvastada haiguse ja siis vastavalt määrata ravi (kiibil on markerid) Paljude haiguste puhul on see juba võimalik: rinnavähk, tsüstiline fibroos, sirprakuline aneemia, kurtus, Huntingtoni tõbi jne.
Helenduvad geenid on lisatud vaid markerina, et olla kindel geeni ülekandes. Albiino jänes hüppab ringi nagu iga tavaline jänku, kuid pimedas toas UV-valgusel hakkab helenduma. Helenduv kärss
Embrüodiagnostika
2. DNA-sõrmejälgede metoodika Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust: Lookusi saab DNA-st välja lõigata ja paljundada väga kiiresti polümerasse ahelreaktsiooni (PCR) meetodit kasutades. Lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid lahuses segamini. See proov pannakse geeli, geel pannakse elektrolüüsi vanni. DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on.
PCR metoodika: Ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat) DNA-polümeraas oma DNA lahus praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema “otsaga”. Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse.
PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele: 92 o. C - DNA denatureerub 58 C - praimerid liituvad 72 o. C - DNA-polümeraas käivitab replikatsiooni. See tsükkel kordub masinas 34 korda.
PCR Fragment, mida tahetakse paljundada Kuumutamisel 90 -ni DNA denatureerub Praimerid ühinevad madalamal temp-l DNA-polümeraas saab replikatsiooni alustada ainult 3` otsast Kuumutatakse 90 –ni, DNA denatureerub
Praimerid ühinevad DNA-polümeraas replikeerib, alustades 3`otsast Need 2 fragmenti on esimesed tulemused. Tsüklit korratakse 34 X, saadakse 30 miljonit
Tulemus: uuritavaid DNA-lõike on paljundatud vähemalt 30 miljonile. Nii suurt kogust saab näha geelelektroforeesil. PCR-masinast võetud DNA-proovid pannakse geeli auku.
• Geel asetatakse elektroforeesivanni, • DNA-lõigud liiguvad + pooluse poole seda kiiremini, mida väiksemad nad on.
Umbes tunni aja pärast näeme UVkiirgusel lahutatud DNA-lõikude “bände” Saame üksteise sarnasusi või erinevusi näha ja võrrelda.
Tänan tähelepanu eest!
- Slides: 73