Qumica Biolgica Patolgica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 2017

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Química Biológica Patológica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 2017 Tema: 1 (d) Aplicadas al diagnóstico

Química Biológica Patológica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 2017 Tema: 1 (d) Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas Dra. Silvia Varas [email protected] edu. ar

TIPO DE MUTACION DEFINE LA TECNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR A USAR PARA EL DIAGNOSTICO

TIPO DE MUTACION DEFINE LA TECNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR A USAR PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) 3º

Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) 3º 1º 2º Mutaciones puntuales 67%

Mutaciones Del/Ins Grandes deleciones (8 %) Pequeñas deleciones (15%) Rearreglos Complejos (1%) Grandes Inserciones

Mutaciones Del/Ins Grandes deleciones (8 %) Pequeñas deleciones (15%) Rearreglos Complejos (1%) Grandes Inserciones y Duplicaciones (2%) Pequeñas Indels (1%) Expansión de repeticiones de trinucleótidos (0, 3%)

Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) 2%

Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) 2% 8% 6, 1% 15% 2% 9 % 56 %

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n n n Grandes Deleciones Southern Blotting

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n n n Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA n Mutaciones Puntuales y deleciones pequeñas n RFLP-PCR(ER-PCR) Mutagenesis mediada por PCR Alelo-Específicas: MAS-PCR ARMS- MARMS DOT-ASO n n n

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II n Desconozco la mutación o polimorfismo

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II n Desconozco la mutación o polimorfismo SSCP (single strand conformation polymorphism) n DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) n

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n Grandes Deleciones n Southern Blotting GAP-PCR

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n Grandes Deleciones n Southern Blotting GAP-PCR Multiplex MLPA n n n

Tipos de Blots n Southern Blot – transfiere DNA y la sonda o probe

Tipos de Blots n Southern Blot – transfiere DNA y la sonda o probe es de ADN n Northern Blot – transfiere RNA y la sonda o probe es de ADN n Western Blot – transfiere proteínas y la sonda o probe son anticuerpos.

The Southern blotting technique

The Southern blotting technique

6: 7: 8 y 9: 10 y 11:

6: 7: 8 y 9: 10 y 11:

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n Grandes Deleciones n Southern Blotting PCR

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n Grandes Deleciones n Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA n n n

PCR Multiplex Es una variante de PCR en donde dos o más loci son

PCR Multiplex Es una variante de PCR en donde dos o más loci son simultáneamente amplificados en la misma reacción. Cuidados especiales: 1 -Los primers de 18 -24 pb deben tener un contenido de GC 35 -60% de esa forma tiene una T anneling de 55 -58ºC o mayor. 2 -Distribuir los amplicones de distintos tamaños. 3 -Diseñar primers con características similares: sin estructura secundaria ni interacciones entre ellos. 4 -Se debe calcular el Tm (no muy diferentes entre primers) y analizar las interacciones entre los primers).

PCR Multiplex Cuidados especiales II: 5 - Se deberá optimizar: Tº extensión, Tiempo de

PCR Multiplex Cuidados especiales II: 5 - Se deberá optimizar: Tº extensión, Tiempo de extensión, Tiempo y temperatura de anneling, número de ciclos, cantidad de primers, concentración de d. NTP y Mg. Cl 2, uso de adyuvantes (glicerol, DMSO, BSA), etc.

sobre la base de 2 series de oligonucleótidos, el promotor muscular (Pm) y 17

sobre la base de 2 series de oligonucleótidos, el promotor muscular (Pm) y 17 exones que cubren las regiones donde se acumula el

sobre la base de 2 series de oligonucleótidos, el promotor muscular (Pm) y 17

sobre la base de 2 series de oligonucleótidos, el promotor muscular (Pm) y 17 exones que cubren las regiones donde se acumula el mayor número de deleciones de la distrofina (Pm, 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52 y 60).

Desde acá

Desde acá

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n Grandes Deleciones n Southern Blotting PCR

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n Grandes Deleciones n Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA n n n

GAP-PCR. Se utiliza un par de primers que flanqueen la zona delecionada (para el

GAP-PCR. Se utiliza un par de primers que flanqueen la zona delecionada (para el alelo mutado) y un primers ubicado sobre la deleción (para el alelo normal). Se generará dos productos de amplificación: - Un fragmento proveniente del alelo normal y – otro fragmento del alelo mutado. El tamaño de cada uno dependerá donde hibridizan los primers diseñados.

Delecion African HPFH-2 Deleción Alelo N (P 1 -P 2): Alelo M (P 1

Delecion African HPFH-2 Deleción Alelo N (P 1 -P 2): Alelo M (P 1 -P 3):

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n Grandes Deleciones n Southern Blotting PCR

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular n Grandes Deleciones n Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA n n n

MLPA (múltiple amplificación de sondas dependiente de ligación) Es una técnica basadas en una

MLPA (múltiple amplificación de sondas dependiente de ligación) Es una técnica basadas en una amplificación cuantitativa por PCR. Presentan la ventaja de permitir el análisis de hasta 40 -50 secuencias blanco simultáneamente. Son técnicas muy usadas para detección de delecciones y duplicaciones del genoma. Se aplica a estudios en genética citogenética e investigación en cáncer humana,

Instrumentos n n n Un termociclador y un sistema de electroforesis tipo de secuencia

Instrumentos n n n Un termociclador y un sistema de electroforesis tipo de secuencia son requeridos para MLPA Los resultados son obtenidos en 24 hs. Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un experimento

Constitución de cada Sonda (Probe) n En la MLPA cada juego de sondas o

Constitución de cada Sonda (Probe) n En la MLPA cada juego de sondas o probes consiste de 2 oligonucleotidos: La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y la sonda oligonucleotido derecha(RPO) (8) n n Cada oligo a su vez contiene 3 partes: La secuencia hibridización (azul) La secuencia espaciadora, opcional (verde) La secuencia donde annealing los primers Fy. R (negro)

Las sondas hibridizan de manera inmediatamente adyacente, de esta manera solo aquellos pares de

Las sondas hibridizan de manera inmediatamente adyacente, de esta manera solo aquellos pares de sondas que encuentran sus secuencias blanco pueden ser ligadas y amplificadas por PCR.

MLPA: Protocolo de ensayo. Las sondas que reconocieron su secuencia blanco y pudieron ser

MLPA: Protocolo de ensayo. Las sondas que reconocieron su secuencia blanco y pudieron ser ligadas son amplificadas por PCR, usando un único par de primers. Todos los amplicones generados deben tener diferente tamaño. Los productos obtenidos son separados por electroforesis capilar y detectados debido a su marcación fluorescente (usualmente en uno de los primers)

Protocolo típico de MLPA

Protocolo típico de MLPA

MLPA: Resultados Las secuencias donde hibridizan primers F y. R son = El tamaño

MLPA: Resultados Las secuencias donde hibridizan primers F y. R son = El tamaño de la secuencia blanco es = El tamaño del brazo espaciador es ≠

VENTAJAS de MLPA: Detección de número de copias de 40 -50 secuencias de ADN

VENTAJAS de MLPA: Detección de número de copias de 40 -50 secuencias de ADN genómicos en una simple reacción, basada en PCR n Requiere únicamente 20 ng de ADN humano (3. 000 células/0, 5 ml de fluido amniótico). n MLPA puede ser usado sobre Ms de ADN parcialmente degradadas tales como ADN extraído de tacos de tejidos parafinados. PROBLEMAS de MLPA: Necesidad de instrumental especifico n Costo n

 • Ejemplo

• Ejemplo

Deleciones

Deleciones

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II n Desconozco la mutación o polimorfismo

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II n Desconozco la mutación o polimorfismo SSCP (single strand conformation polymorphism) n DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) n

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única) n SSCP (single strand conformation polymorphism) es

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única) n SSCP (single strand conformation polymorphism) es un método simple y accesible para detectar alteraciones en la secuencia en un fragmento obtenido por PCR

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única) La técnica de SSCP detecta variaciones en

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única) La técnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros pequeños cambios) debido a la generación de diferencias en la movilidad electroforética. Bajo condiciones no desnaturalizantes, las moléculas de ss. ADN asumen conformaciones únicas que dependen de su secuencia de nucleótidos. Los cambios conformacionales producidos por variaciones en la secuencia de ADN pueden resultar en diferencia detectables por la movilidad en un gel.

1. Amplificación zona interés. 2. La muestra se enriquece en ss. ADN por medio

1. Amplificación zona interés. 2. La muestra se enriquece en ss. ADN por medio de una PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de los primers en mayor cantidad que el otro. 3. Desnaturalización del producto PCR con (formamida)+ 100ºC- 5’. 4. Las movilidades de los fragmentos simple cadena se comparan mediante electroforesis en un gel neutro de poliacrilamida. 5. Las bandas son detectadas con tinción con plata. PCR 2 ul PPCR+ 10 ul formamida Rápido enfriamiento

Gel poliacrilamida 6% SSCP Después de la tinción, el gel se puede dividir en

Gel poliacrilamida 6% SSCP Después de la tinción, el gel se puede dividir en dos partes: la parte con las bandas correspondientes a los alelos de simple cadena (SS) Inserción Deleción Mutación Aa Mutación aa AA y la otra parte con las bandas de doble cadena (DS) donde se pueden distinguir pequeñas deleciones o inserciones. El carril 1 corresponde al patrón WT para cualquier locus dado analizado. 2 - Control homocigota para la mutación a 3 - Corresponde a un caso heterocigota para mutación a. 4 -Heterocigota pequeña deleción. 5 - Homocigota para una pequeña deleción. 6 - Heterocigota para una pequeña inserción.

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Los productos de PCR son cargados en un gel

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Los productos de PCR son cargados en un gel con un gradiente desnaturalizante simple complejo 20% Típicamente 20 -80% formamida ADN doble cadena migra hasta encontrar su melting El melting es determinado por su secuencia y contenido de GC 80% Las diferentes secuencias migran a diferentes distancias

n Alguna pregunta?

n Alguna pregunta?